玄参HPLC/UV 指纹图谱研究

[摘　要] 　目的:采用HPLC/ UV 法对玄参药材进行指纹图谱的研究。方法:采用Agilent ZORBAX SB2C18柱(250 mm×416 mm ,5μm) ,甲醇和011 %甲酸为流动相梯度洗脱,流速:1 mL/ min。结果:得到分离度、精密度和重复性均较好的玄参药材HPLC/ UV 指纹图谱。结论:本方法可用于玄参药材的指纹图谱测定,并为其全面质量控制提供参考。
[关键词] 　玄参;指纹图谱;HPLC;质量控制
    玄参为常用中药,具有凉血滋阴、泻火解毒之功效,药典规定玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl1 的干燥根,但未见收载其质量控制方法。中药指纹图谱是近年提出的、目前国际上公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段之一,是推动行业全面进步的关键技术之一[。本文采用HPLC/ UV 方法对玄参药材的乙醇提取物进行分离分析,得到了分离度、精密度和重现性均较好的药材指纹图谱,为全面评价玄参药材的质量提供了参考。
1 　仪器与试剂
    Agilent 1100 LC/ DAD 系统,含在线真空脱气机、低压四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、光二极管阵列检测器,HP Chemstation 色谱工作站。甲醇(色谱级) ,甲酸(分析纯) ,双重蒸馏水;玄参药材产自浙江磐安,经中国药科大学中药学院徐珞珊教授鉴定为玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl1 ; 肉桂酸对照品由金陵药业股份有限公司技术中心提供。
2 　方法与结果
2.1 　供试品的制备：取玄参药材适量,60 ℃干燥4 小时,粉碎,过40目筛。取药材粉末5.0 g ,置100 mL 锥形瓶中,加无水乙醇50 mL ,超声30 min ,滤过。取续滤液5 mL 挥干,加2 mL 50 %甲醇溶解,用0145μm 微孔滤膜滤过作为供试品溶液。取肉桂酸对照品适量,用50 %甲醇溶解,制成每毫升含150μg 的溶液作为参照物溶液。
2.2 　液相色谱条件及分析方法
    色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18 柱( 250 mm×4.6 mm ,5μm) ;流动相:A :0.1 %甲酸,B :甲醇;梯度洗脱: 0 min : 40 %B ,25 min : 60 %B ,45 min : 90 %B ,60 min :stop ;流速:1 mL/ min ;柱温:25 ℃;检测波长:280 nm;参比波长:400 nm;进样量:20μL 。
2.3 　方法学考察
2.3.1 　空白试验：吸取溶剂20μL ,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见图1（略）。
2.3.2 　对照试验：吸取参照物溶液20μL ,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见图2（略）。
2.3.3 　精密度试验：取供试品溶液(批号3) ,连续进样6 次,测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 小于1.0 % ,表明进样精密度良好。
2.3.4 　重现性试验：取供试品药材(批号3) 6 份,分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液,并进样分析,测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 小于2.8 % ,表明方法重现性较好。
2.3.5 　稳定性试验：取同一供试品溶液(批号3) ,分别在0 ,2 ,4 ,6 ,8 ,12 ,24 h 进样,测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 小于1.9 % ,表明样品溶液在24 h 内稳定。
2.4 　玄参药材指纹图谱及各项技术参数：根据测定的同一产地10 批药材的指纹图谱,并参照“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) ”,经比较发现其中8 个峰是各批供试品所共有的,且峰面积较为稳定,因此确定这8 个峰为共有指纹峰。标准玄参药材指纹图谱见图3（略） ,10 批供试品检测结果见表1、表2 和表3。
    指纹图谱的技术参数:共有峰的峰号(相对保留时间) : 1 (0.363) , 2(0.637) , 3 ( 0.778) , 4 ( 1) , 5 ( 1.413) , 6 ( 2.140) , 7(2.161 ) , 8 ( 2.187 ) ; 峰面积比值: 1 ( 0.154 ) , 2(0.334) , 3 ( 0.220) , 4 ( 1) , 5 ( 2.014) , 6 ( 0.203) , 7(0.721) ,8 (0.535) 。
    相似度作为目前中药指纹图谱的一个重要评价参数,可以最大限度地避免主观因素的影响,从而实现对指纹图谱整体相似性的客观定量评价。本文采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版,对10 批药材的相似度进行计算,结果表明10 批药材的相似度在0.98 以上。
3 　讨　论
3.1 　供试品溶液的制备
    玄参药材中的有效成分主要为肉桂酸、葡萄糖苷类,通过对不同浓度的甲醇、乙醇等提取溶剂进行考察,表明无水乙醇的提取效率最优。对多种提取方法的考察表明冷浸提取方式耗时长,提取效率不高,而超声提取与加热回流相比,提取效率相仿,且操作简单。
3.2 　参照物的选择
    玄参中的特征性成分肉桂酸含量较高且稳定,其色谱峰与其他峰分离良好,各批样品中均有此峰,保留时间适中,故选作参照物。
3.3 　流动相及洗脱梯度的选择
    玄参中所含的化学成分如肉桂酸等在紫外- 可见光区有较强的吸收,可用常规的UV 检测。经对DAD 三维光谱图考察,在280 nm 处各吸收峰吸收均较强,故选其为检测波长;在400 nm 处供试品没有吸收,因此选择其为参比波长。玄参所含化学成分复杂,难以找到理想的等度洗脱条件。为使尽可能多的化学成分得以在指纹图谱中体现,因此采用梯度洗脱。在充分考虑药材中各种化学成分理化性质的基础上,参考相关文献,考察了甲醇- 水、乙腈-水、甲醇- 冰醋酸水和甲醇- 甲酸水等多种色谱系统和梯度洗脱程序,以出峰多、分离好,并确保主要化学成分在指纹图谱中出现为标准,最终确定HPLC的检测条件。
3.4 　指纹图谱的建立
    10 批次玄参药材指纹图谱表明:不同批次药材指纹图谱相似度虽然在0198 以上,但各成分相对含量仍然存在差异,这种差异可在其指纹图谱中得以清晰、定量的反映,说明指纹图谱不失为控制中药和天然药物质量的有效手段之一。同时也说明制定指纹图谱标准时所采用的药材必须遵循“五固定”的原则,才可确保方法的重现性,从而为玄参药材的鉴别提供可控、可行的手段。
3.5 　指纹图谱各色谱峰的定性
    在制定指纹图谱标准时,曾尝试应用液- 质联用仪[ ESI( ±) 离子源] ,以期能对指纹图谱各色谱峰进行定性。但是由于玄参药材提取液主要成分为葡萄糖苷类,结构不稳定,应用质谱仪检测时,易产生碎片,不能得到分子离子峰,故无法进行定性。

作者：余静, 张尊建, 杨春华