中药指纹图谱的构建及计算机解析

【机　构】 中山大学生命科学学院，广州510275 第一军医大学，广
【刊　名】中药材.2001,24(4).-295-298 
【文　摘】 近年来随着仪器分析技术及计算机信息处理技术的迅猛发展，中药指纹图谱技术应运而生。指纹图谱技术监控中药质量的目的是：确定中药材（或中成药）的真伪，判定其质量是否稳定。构建中药指纹图谱的方法很多，主要有：（1）色谱法，其中最引人注目的当属裂解气相色谱和三维高效液相色谱。另外，高效毛细管电泳技术、以超临界流体萃取为前处理的气相色谱－质谱联用技术，也大大丰富了中药指纹图谱构建的内涵。（2）光谱法、包括紫外光谱和红外光谱。但其鉴别专属性差，分辨率低，需借助计算机模式识别技术或模糊数学方法进行处理。（3）X射线衍射法。（4）分子生物学技术，特别是随机扩增多态DNA（RAPD）标记，可以在特异NA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新技术，具有极好的应用前景。中药指纹图谱的计算机解析方法有模糊信息分析法、人工神经网络法及灰色关联度聚类法等。在构建中药指纹图谱时应注意考虑：样本要有明确的纳入标准、样本量要适当、尽可能设立对照。近年来笔者已成功地构建了中药材黄芩、苦丁茶、细辛和中成药华佗再造丸、乌鸡白凤丸等指纹图谱并进行了计算机解析，这是一项很有意义的工作。 
    中药现代化是中药产业可持续发展的根本出路。中药材(中成药)的质量监控是中药现代化进程中亟待解决的关键问题之一。近年来随着仪器分析技术及计算机信息处理技术的迅猛发展，中药指纹图谱技术应运而生。应用指纹图谱监控中药材(中成药)的质量是否稳定，在国内已逐渐成为一种趋势，在国外也越来越多地受到关注。
    众所周知，中药发挥药效的物质基础是其内起协同作用的各种化学成分。由于中药所含成分的复杂性，在日前的技术条件下，要想测定中药内的所有化学成分简直是天方夜谭。但这并不意味着我们对中药的监控就束手无策了。不同种中药之间的区别、同种中药内(因产地和采收期不同)的差异，归根结蒂在于其内化学成分的组成和含量存在差异，这种差异可以通过现代分析手段，用中药的指纹图谱特征反映出来。
    中药的指纹特征必须既具有“共性”又具有“个性”。所谓“共性”，应能体现出不同产地、不同采收期的同种药材(或不同批号的同一种成药)共同具有某些特征(如色谱中的共有峰)。所谓“个性”，包含两层含义：(1)必须反映出该药材(或成药)有别与其他任何物质；(2)对于中药材，指纹特征还能反映出产地和采收期不同而造成的差异；对于中成药，则能反映出同一产品不同批次间的质量差异。差异越小，说明药材(或成药)的稳定性越好。指纹图谱技术监控中药质量的最终日的是：确定中药材(或中成药)的真伪，判定其质量是否稳定。
1  中药指纹图谨的构建
    构建中药指纹图谱的方法很多可根据需要，选用一种或几种方法。
1．1  色谱法  日前应用员广泛的是薄层色谱，由于方法简便、设备易得，非常适合我国的国情。近年来，更为先进的色谱技术也逐步在推广使用。其中最引人注目的当局裂解气相色谱和三维高效液相色谱。裂解气相色谱具有操作简便、样品无需化学前处理、提供信息量大等优点。该方法将样品故人裂解器内，在——定条件下将样品加热使之瞬间裂解．生成可挥发的小分子物质，立即被载气带人气相色谱系统的分析柱上，分离后在记录仪上获得重复特征的裂解气相色谱图，它具百指纹性质。而高效液相色诺具有重现性好、流动相选择性广、色谱校可反复使用等特点，特别是三维高效液相色谱，近年来发展很快．非常适合构建中药指纹图谱。最近出现的高效毛细管电泳技术是以高电场为驱动，毛纫管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术，具有高效、高速、高灵敏度等优点，可用于中药指纹图谱的构建。另外以超临界限流体萃取作为前处理手段的气相色谱。质谱分析法．也大大丰富了中药指纹图谱构建的内涵。
1．2  光谱法  紫外光谱和红外光谱作为中药鉴别的辅助手段，近年来发展较快。中药紫外光谱特征的差异，在一“定程度上反映了中药化学成分的差异。某些情况下，伪品虽可在外观上以假乱真．但其化学成分的组成及含量与正品必有差异，这种差异在紫外光谱上必有所反映c如果中药亲缘相近而紫外光谱不易区别．可采用多阶导数光语法提高分辨率.红外光谱一直是药品鉴定的权威方法．但这是对纯物质而言的。中药提取液是一个大的混合物，这一
混合物的红外光诺在本质上与纯化合物红外光谱不同．它是混合韧中各组分红外光谱的叠加。中药内各种化学成分只要质和量相对稳定，并且样品的处理方法按统一要求进行．则其红外光谱应该是相对稳定的。因此，这样得到的混合物红外光谱应该具有一定的客观性和可重复性。中药品种不同．则组成它们的化学物质也就不同。中药在化学成分上的差异，必定在其红外光谱上有所反映。把中药正品、伪品中的化学物质按不同的极性提取出来，这样，不论它们之间存在的不同物质是什么，一般都会在某一种或几种溶剂提取物中出现．从而反映到红外光谱上，依据红外光语指纹特征可甄别中药真伪.应该指出，紫外光诺和红外光谱都具有加和性，对于混合物来说，其鉴别专属性差，分辨率低。需借助计算机模式识别技术或模糊数学方法进行处理。
1．3  x射线衍射法  当某一物质进行衍射分析时．该物质校x射线照射而产生不同程度的衍射现象。物质的组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱.如果读物质是一混合物，则所得衍射图是各组分衍射效应的叠加。只要这混合物的组成是恒定的，其衍射图就可以作为该混合物的特征图谱。中药尽管组成复杂(包括有机和无机物的多相体系)．但当产地、采收期等影响因素相对稳定后，其组成也是稳定的，因而其衍射信息也是—’定的。由于各种药材的组成成分各不相同，它们的衍射图谱便各有特征，据此可用于中药的鉴别.
1．4  分子生物学方法  近年来人们认识到核苷酸序列含有生命有机物构建、维持和繁殖生命所必需的遗传信息，不同种生物体含有不同的DNA序列．同种生物体既有相同的DNA序列，保持同种生物体的遗传性状．又有其多态性，使同种生物体内各个体干差万别。由于这种核昔酸序列是相对稳定的，因而可以利用现代分子生物学技术构建DNA指纹图，DNA指纹图具有高度的个体特异性。限制性内切酶片段长度多态性(BM)是最常用的构建DNA指纹图的方法，但该法费时费力，应用受到限制。随机扩增多态D NA(RAPD)标记．可以在特异DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性．这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景
。
2  中药指纹图谱的计算机解析
    中药的指纹图谱相当复杂，人工比较难免影响结果的难确性。若将其与计算机图谱解析和识别技术结合起来，其应用前景将大为扩展。目前员先进的计算机图谱解析技术有如下几种。
2。1  模糊信息分析法  该方法是对模糊事物进行划分、判断或推理的方法。事物的模糊性是指客观差异的中介过渡性所引起的划分上的一种不确定性。所谓差异的中介过渡性，是指从差异的一方(如中药真品)到差异的另一方(如中药伪品)，所经历的从量变到质变的中间过程。毫无疑问，中药的指纹图谱特征具有一定的模糊性，通常采用“隶属度”来反映这种模糊性．即用隶属度来判别中药的真伪。通常情况下，模糊信息的特征可以在确定性信息、随
机性信息的比较中显示出来。所谓确定性信息，是指人们据此可以总结出必然规律的信息；而随机性信息，是人们据此可以总结出统计规律的信息。模糊信息的特征就是这种信息给人们提供一种模糊依据．使得人们可以根据这些信息对其相应的必然规律或统计规律进行模糊识别。就中药的真伪甄别而言．计算机模糊识别的基本步骤是：(1)特征提取．即从中药的指纹图谱中获取能够反映其品质的数量化特征。特征提取时，应遵循这样的原则：尽可能舍弃对分类决策无影响的信息．而对分类决策有影响的信息应全部保留，否则会影响分类决策的准确性.(2)依照某种方式确定该中药指纹特征对“真模式”、“假模式”的隶属度G(3)用最大从属原则或团值原则确定该中药样品的真伪.
2．2  人工神经网络法  该法是模拟人脑功能的全新信息处理方法，其理论基础是神经网络的数学模型。此处所说的神经网络并不是生理上所说的真实的神经网络，而是真实神经网络的一种数学抽象。神经网络系统中包含着大量的基本信息处理单元，称为神经元或节点。神经元之间具有十分复杂与丰富的相互联接关系，这种联接关系的强度用一种可变的权值表示c根据一定的学习规则．通过改变神经元之间的联接强度以适应所处理的问题，因而神经元具有学习功能G神经网络对于处理那些关系石明确、背景不清楚、推理规则不确定的问题具有独到之处，非常适宜处理中药指纹图谱信息.反向传播模型是目前应用最广泛的人工神经网络模型，具有判别分类可靠性大、判别速度快等优点。BP网络由具有多个节点的输入层、隐含层和输出层组成。它们分别对应于系统的输入、过渡和输出。BP网络的运行过程分两步：首先利用一组已知结果的样本构成训练集，对于每一个样本的输入，根据前向传播得到一个输出结果，然后计算输出结果与朗望输出结果之间的误差，这些误差由输出层反馈到输入层，以此修正各个节点之间的联接权值.反复这…过程，直到整个训练样本集的每一个模式和每一个输出单元的误差都小于某个特定值，训练才结束。经过训练的网络，把系统规则、预测能力、变量转化都以权值的形式隐含在网络之中，然后向输入层输人信息，即可给出处理结果.
2．3  灰色关联聚类法  灰色系统是既包含已知信息，又包含未知信息的系统。由于中药指纹图谱信息具有灰色性，可用灰色系统理论中的灰关联聚类法进行处理。该方法以定义的相对关联度为测度，构建一种全新的模式识别模型。设有若干个中药样本．每个样本有若干项指纹特征量化指标．这样组成了评价单元序列。用灰色关联度作为评价测度．首先必须选择参考序列．然后计算相对于最优参考序列的关联度l和相对于最差参考序列的关联度越大，表明评价单元序列与最优参考序列的关联愈甚．评价单元愈佳；rl意义正好相反，t愈小，评价单元愈佳。理想的最佳评价单元应该是：它与最优参考序列的关联程度最大．同时与最差参考序列的关联最小。因此．可定义同时相对于最优参考序列和最差参考序列的相对关联度n＝L／(Llrl)。显然，rI愈大，评价单元愈佳。可根据各评价单元相对关联度的大小．给出各评价单元的优劣顺序。这样可最终得出中药质量优劣的评价结果。
3  构建中药指纹图谱应注意的问题
3．1  样本要有明确的纳入标准  (1)若构建的指纹图语用于甄别某种中药材的真伪．应考虑不同产地和不同采收期对中药材质量的影响。因此，为保证所选的研究对象具有代表性，所选的样本应包括不同产地、不问采收期的该种药材．确保所选样本能代表该品种的样本总体c(2)若构建的指纹图谱用于判定产地和采收朗已固定的某种中药材质量是否稳定，则应尽可能收集历年来同产地、同采收朗的该药材样本c(3)若构建中成药指纹图谱，应在确保该
产品所用原料产地、品种、采收期和加工方法固定的前提下．收集该药足够多的不同批号的样本．方可判定该产品的真伪及质量是否稳定。
3．2  样本量要适当  样本量的实质是代表性的问题．在纳入标准明确的前提下．样本量越大，越接近总体的真实话况，抽样误差和随机误差小，代表性好．结论更可靠。但样本量大．花费的人力物力也多，有时样本来源也有困难。样本量小，则易导致偏差.因此，样本量要适当。
3．3  尽可能设立对照  设立对照是构建中药指纹图谱的重要原则之一。对于中药材，可将中国药品生物制品检定所提供的标准药材作为对照品，构建该品种的“标淮指纹图谱％，即标淮模式。也可将公认的地道产区样品或严格按附要求生产的该品种药材样品作为标准对照。
4  应用实例
4．1  黄芩薄层色谱的计算机解析  黄芩是一种常用中药．目前临床上使用的除中国药典收载的正品黄芩外，还有多种代用品。笔者曾对10个不同产地的5种黄芩(正品黄芩、甘肃黄芩、粘毛黄芩、滇黄芩、丽江黄芩)进行薄层色谱分析，薄层色谱定性地反映了不同样品所含化学成分的差异。依据斑点的有无，将薄层色谱解析成计算机能够接受的0和1组成的矩阵．依据模糊聚类分析法对样品进行鉴别分类。聚类分析结果还反映出正品黄芩与4种非正
品黄芩差异的大小j。
4．2  苦丁茶HPLC指纹图谱的计算机解析  苦丁茶为常用中药，具有散风热、清头目、除烦渴等功效。目前市场上出售的商品苦丁茶的主流是冬青科植物拘骨叶和大叶冬青叶，此外尚有木惮科植物女贞叶在部分地区也作苦丁茶使用。笔者采用反向传播人工神经网络计算机模式识别技术．对78个商品苦丁茶侧指纹图谱进行处理，实现厂苫丁茶样品的计算机快速鉴别。
4．3  细争气相色谱—质谱和x射线指纹图谱的计算机解析  细辛为常用中药，来源于马兜铃科植物北细辛、汉城细辛、华细辛的干燥全革。笔者对细辛挥发油成分进行GC—MS分析．用计算机模式识别技术处理CC—M5指纹图谱数量化分类特征，实现了计算机快速鉴别。此外，用主分量分析—聚类分析技术处理细辛x射线荧光谱，建立厂细辛样品的聚类谱系图谱。
4．4  华俏再造九指纹图语的计算机解析  笔者对广州奇星药厂生产的华伦再造九进行了薄层色谱分析，可作为真伪鉴别的依据”j。此外．还对华伦再造九进行了气相色谱分析，获取了其气相色谱指纹特征，在此基础上．进一步采用特征指标均值伯移度法对其质量进行了评价。
4．5  乌鸡白凤九指纹图谱的计算机解析  笔者对广州陈李济药厂生产的乌鸡白风九石油醚提取物进行了气相色谱分析．获取了其气相色谱指纹特征，并用计算机模式识别技术建立了综合评价乌鸡白风丸质量的新方法。