细胞周期的测定

　　一、原理

　　细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

　　单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

　　测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

　　BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

　　二、仪器、用品与试剂

　　1、仪器、用品：同常规细胞培养

　　2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

　　三、操作步骤

　　1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。

　　2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

　　3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

　　4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。

　　5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

　　6、弃去2×SSC液，流水冲洗。

　　7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

　　8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

　　9、计算：

　　细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时）

　　附：（1）BrdU配制： BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

　　（2）2×SSC配制： NaCl 1.75克，柠檬酸三钠•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。