Ⅰ、将经荧光标记的抗体进行稀释。如果浓度过高，背景会因为的非特异性的相互作用的增加而增加。
Ⅱ、在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。
Ⅲ、在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。
通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。
Ⅳ、使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。
Ⅴ、在预料不到的已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的物质的交叉反应会引起背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应以减少与这些从流式培养中产生的免疫球蛋白的结合。这些种类的蛋白存在于细胞表面或组织中，或额外加入的作为第一抗体和其他第二抗体的蛋白。交在多重标记过程中，通过使用来源于一个单个寄主个体的已标记抗体，多功能第一抗体和第二抗体的交叉反应也可以被吸附，以避免和其他寄主个体进行交叉反应来减少背景影响。
作者：
2007-9-25