标记抗体的免疫放射技术(IRMA)

　　（一）原理 IRMA是采用过量的标记抗体与待测抗原的非竞争性结合反应，然后加入固相的抗原吸附剂以结合游离的标记抗体，离心去沉淀，测定上清液中的放射性强度，从而推算出待测样品的抗原含量。 （二）放射免疫检测与免疫放射检测(即IRMA与RIA)的区别 见表13－4。 表13－4IRMA与RIA的区别

	IRMA	RIA
标记物质	抗体	抗原
标记物用量	过量	限量
反应方式	直接结合	竞争性结合
B、F分离方式	固相抗原免疫吸附剂	第二抗体等

（三）标记抗体的制备 特异性抗体的制备，质量要求及¹²⁵I标记方法与RIA基本相同。抗体IgG分子中含有多个氨基酸残基，经过碘化反应后，不影响其免疫学活性，并能结合上较多的碘原子，标记物的比放性高，克服了RIA中某些抗原不易标记，或在标记过程中容易发生化学或放射性损伤等缺点。同时纯化的抗体比抗原的纯品来源更为丰富。标记抗体的方法比较单一，也易于掌握，不同于标记抗原，每一种抗原必须标记一次，且抗原复杂，多种多样，标记方法也多种多样。如果将抗体分子酶解成Fab片段，形成单价抗体，再进行标记，这样其敏感性将显著高于一般的IRMA。 （四）免疫吸附剂的制备 免疫吸附剂是将高纯度的抗原连接在固相载体上而制成。所用固相载体要求对抗原的结合力强，对非特异性蛋白质的吸附性能低，且具有高度的分散性，这样才能大量地结合特异性抗体。一般采用重氮化的纤维素、溴化氰化的纤维素、琼脂糖4B珠、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶和玻璃粉等作为抗原吸附剂的固相载体。 近年来发展建立的双抗体夹心IRMA法，用固相抗体代替抗原免疫吸附剂，反应后形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，经过洗涤即可除去游离的剩余标记抗体，简化了分离步骤，并保证了较高的特异性。 固相抗体的制备方法有两种：一种是物理吸附法，将塑料小珠浸泡在稀释的抗体中，用前经过洗涤即可。或者将抗体吸附在塑料试管中；另一种是采用化学连接法，将抗体较牢固的结合，这样洗涤时不易脱落，塑料小珠浸泡的条件是50mMol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，抗体的浓度为IgG 0.1μg/ml～100μg/ml。塑料试管吸附抗体的条件是抗体浓度0.1μg/ml～100μg/ml 37℃、4h～6h或4℃ 24h。 （四）测定方法 根据试验设计的特点，可分为以下几种类型。 1．直接IRMA法 将待测抗原与过量的标记抗体进行温育，使二者结合。然后加入固相抗原免疫吸附剂再次温育，吸附游离的标记抗体。离心去除沉淀物，测定上清液中放射性强度。根据标准曲线即可得知待测样品中的抗原含量。 2．双抗体夹心IRMA法 在待测抗原内依次加入固相抗体(或将待测品直接加入抗体包被管内)和标记抗体，反应后形成固相抗体(Ab_l)－抗原－标记抗体(Ab₂)复合物。洗涤除去未结合的游离标记抗体。测定固相抗体或载体上免疫复合物的放射活性，根据标准曲线求得待测得抗原量。此法仅适用于检测有多个抗原决定簇的多肽和蛋白质抗原。 3．间接IRMA法 此法是在上述双抗体夹心法的基础上，进一步改良为¹²⁵I标记Ab₂的抗体，反应形成的固相抗体(Ab₁)－抗原－Ab₂－标记抗体(^﹡Ab₃)的四重免疫复合物。其中标记抗体(^﹡Ab₃)可做为通用试剂，由于同种Ab₂的各种IRMA，省去了标记针对不同抗原的特异性抗体。 4．BAS－IRMA法 是将生物素－亲和素系统引入免疫放射分析，建立了新一代IRMA。此法的最大优点是使用生物素的抗体和以¹²⁵I标记亲和素为示踪剂，可以通用于甾体类、甲状腺素、前列腺素等多种分子物质的检测。固相半抗原结合物经过无水乙醇处理，结合非常牢固，可长期保存；反应和测定在同一试管内完成，操作十分简便，适用于IRMA技术自动化检测。