5-3-4 转位因子

• 抗药性基因
• 转位作用的调节
• 转位作用机制
• 转位作用的某些遗传效应

　　细菌体内编码抗药性（例如抗四环素和青霉素）的基因存在于质粒中。质粒与细菌染色体之间几乎没有什么同源性。然而带有这样质粒的细菌，其抗药性基因偶而也会出现在细菌染色体中或菌体内噬菌体的后代中。显然这是一种没有同源性的重组作用的后果。这种抗药性基因定居在新的基因组中后，还能继续迁移（例如从细菌DNA到另一个质粒等）。当然，这并不是常见的现象，其机率在一百万次细胞分裂中还可能不到一次，但是由于其带有抗药性基因，很容易被检查出来。用电子显微镜技术（检查有无异源双链）和用限制酶分析均可发现有新的DNA序列的插入。这种不依靠同源性而能移动的DNA节段即称为转位因子（transposable elements）。已知转位因子的大小为750-40000bp。转位因子的发现是70年代末分子生物学发展中的大事，成了人们关注和研究的中心问题。

　　细菌中的转位因子主要可分为两类：一类比较简单，称为插入序列（insertion sequence，IS）。另一类则较复杂，称为转位子（transposon，Tn）。转位子含有（除转位所必须的基因外）一到几个基因；如果这些基因中有的有抗药性或能产生毒素，即可作为遗传标志而很易被鉴定出来。IS中则仅含有编码其转位所需的酶（转位酶，transposase）的基因。一般说来，被IS所插入的基因将被失活，而且IS可含有启动子，能促使RNA聚合酶起始转录并使其邻近的基因得到表达。

　　转位子常常在其两端含有IS或IS的一部分。这提示转位子可能是细胞基因的两端各装上一个IS而形成的；后来装置就能像IS一样移动，而两端的IS却反而不能独立移动了。

　　几乎一切生物中都有转位子。E.coli的某些转位子列于表7－1中。真核生物中亦有转位子，如酵母有Ty因子，果蝇有copia因子等。逆转录病毒本身实际上就是转位子。

　　一、抗药性基因

　　由于转位子可以进行无同源性重组，就可将多种抗药性基因集中到一个质粒上，使宿主菌能抵抗多种抗生素，这就造成了严重的医疗问题。

E.coli的某些插入序列和转位子

　　天然存在的质粒R1能抗氯霉素（Cm）、卡那霉素（Km）、链霉素（Sm）、磺胺（Su）和氨苄青霉素（Ap）。在R1中这5个抗药性基因都装配在一起，称为抗性决定子（r-determinant）。抗性决定子再和有DNA复制功能的基因连起来，组成整个质粒。后二者合称为抗性转移因子（resistance transfer factor RTF）。这种装置的可伸缩性很大，因此可以形成形成许多不同型的质粒，不论在自然界中或在实验室均是如此。

　　二、转位作用的调节

　　抗药性基因不过是转位子所载的“货物”，转位子本身才能决定和指导转位的频率。转位因子有两个主要特性：①在其两端有长20-40bp的反向重复序列（inverted repeats）；②大多数转位因子均编码转位酶，后者能催化转位因子插入新的位点。在插入位点的两侧有3-11bp的同向重复顺序（direct repeats），IS5的结构及其靶序列见。

　　转位子Tn10每一分子在每一代中平均仅产生少于1分子转位酶，是以细胞内转位酶的浓度极低。这就使天然Tn10的转位频率约为10^-7/拷贝，即在10⁷个细菌世代中Tn10只有一次转位。然而如果我们用人工方法放入含有Tn10转位酶基因的质粒以产生更多的转粒酶，则Tn10的转位频率可提高一千倍。所以天然转位的频率似乎由转位酶的水平所控制。

　　最近发现了决定转位酶表达及其功能的因素。Tn10和某些其他转位子的转位酶基因的启动子均含有GATC这一序列，而在E.coli细胞内有dam甲基化酶，能将GATC中的A甲基化。因为与5’GATC3’互补的序列也是5’GATC3’，故在此位点上DNA的两条链均被甲基化。在这种情况下启动子的活性很低。然而，当DNA复制时，在新生的子链中GATC中的A在大约1min内尚未来得及甲基化。这个位点就呈现所谓半甲基化状态（hemi methyated state），此是时启动子活性很高，能在复制后的短时间同人产生出相当数量的转位酶。同样，在Tn10DNA上，转位酶所作用的位点也含有GATC，在这个短时间同他仅有一条链是已甲基化的，因而亦是转位酶的良好底物。所以，总的说来Tn10喜欢在DNA复制后立即转位。现在尚不清楚是否有其他情况能影响甲基化，从而改变转位的频率。

　　某些转位因子还编码第二种酶，称为解离酶（resolvase）催化转位的第二阶段反应。 对Tn3，解离酶另有一独立功能：它是它本身基因和转位酶基因的阻抑蛋白，以便使二者的表达在正常时处于低水平。它与转位因子DNA上这两个基因之间的一个位点相结合，从而同时抑制这两个基因。

　　三、转位作用机制

　　现以Tn3为例，来说明转位作用的机制：①转位子转位是很精确的，它携带原位点上的全部插入序列，但并不包括即使是一点点邻近的DNA序列。这只有在转位酶能够识别转位子的两端时才有可能。因此，这两个端点必然是一样的，因为它们是转位酶的共同结合位点。②在插入部位处有靶序列（3到12个碱基，取决于转位子的类型不同）的精确重复；它在转位子的两端各有一个拷贝。显然发生了DNA合成才能产生这样的重复（注意，λ噬菌体的整合作用就没有这样的重复）。③虽然大多数转位子可以转移到一个新的基因组中的几乎任何部位处，但它们也不能完全随机转移，而是对某些DNA序列有倾向性。它们倾向于插入特异的4或6bp的序列，就好像限制酶一样。

　　Shapiro在1980年提出了转位模型。后来人们又提出了各种各样的模型。目前认为，转位酶能与转位因子两端相结合，并且也和转位因子将要插入的DNA靶序列相结合。然后转位酶在靶上作出交错的切割，好象限制酶一样，并同时在转位因子的两端也各进行单链的切断，这个切断必须在两条不同的链上。所产生的转位因子游离端于是和靶序列的游离端相连接，这样就将两个DNA分子连接起来，即靶序列两端各有一条链和原转位因子的一个游离端相连。然后有两条路可走，取决于当时的情况和转位因子的类型。

　　⑴简单转位作用：第二次切割转位因子两条链的另一端切断，并将转位因子整个转移到新DNA分子上；而在原来宿主DNA上留下一个致死性的“空隙”。DNA聚合酶的功能在这里不过是插入几个核苷酸以完成靶位点的复制而已。因此，简单转位作用只是将转位因子转移到新的位点上。

　　⑵复制转位作用（replicative transposition）：转位因子被复制，一个考贝转移，另一考贝留下，故原来宿主DNA上不留“空隙”，不被破坏。在这种情况下不进行第二次切割，而是在第一次切割进留下的断端处，由DNA聚合酶起始复制转位因子的第二条链，从而形成共联体（cointegrate）。共联体的存在是复制转位过程的确切证据。然后由解离酶催化两个转位因子考贝间位点特异性重组，基过程类似λDNA的整合反应，从而产生两个分离的DNA分子，每个均带有一个考贝转位子。最近的一些实验证明，在高等生物中，某些转位子（特别是和逆转录病毒类似的转位子）的移动方式与原核生物的转位子（如Tn3）很不同。例如酵母中的Ty成分首先要转录成为RNA，再用逆转录合成DNA。这个新的DNA考贝然后与宿主染色体上的一个新位点发生重组。其详细机制尚不清楚。

　　四、转位作用的某些遗传效应

　　了解了转位作用的机制后，就可以明白转位作用有时可以产生一些其他效应。现举例如下。在同一DNA分子中转位至另一位点可引起缺失或倒置P230复制子融合（replicon fusion）：在转位过程中产生的共联体可以通过解离酶使之分离。但是有时不存在解离酶（例如有些转位因子不含解离酶基因），那末共联体就不是中间产物，而是最终产物了。这就是复制子融合。外加两个转位因子转位作用尚可引起缺失或倒位。

　　当转位作用发生于同一DNA分子的内部时，如果转位子以反向顺序插入靶顺序，则经过位点专一性重组交换，即发生b和c倒位。如果转位子以顺向插入靶顺序，在解离后将生成两分子DNA。其中只有一个含有复制起点（位于a和d之间），而另一DNA分子则不含，由于无复制能力，将随细胞分裂而丢失。剩下有复制起始点的DNA分子则缺失了b和c。