Literature
首页合作平台医学论文临床医学与专科论文检验医学

人重组白细胞介素-6对大鼠海马神经元Bcl-2表达的影响 △

来源:中国神经免疫学和神经病学杂志
摘要:人重组白细胞介素-6对大鼠海马神经元Bcl-2表达的影响△中国神经免疫学和神经病学杂志1999年第1期第6卷论著作者:丁爱石王福庄傅群武周长满范明单位:丁爱石王福庄傅群武范明军事医学科学院基础医学研究所神经生物室,北京100850。Bcl-2。海马神经元。免疫组化摘要目的观察重组人白细胞介素-6(rhIL-6......

点击显示 收起

人重组白细胞介素-6对大鼠海马神经元Bcl-2表达的影响

中国神经免疫学和神经病学杂志 1999年第1期第6卷 论  著

作者:丁爱石 王福庄 傅群武 周长满 范明

单位:丁爱石 王福庄 傅群武 范明 军事医学科学院基础医学研究所神经生物室, 北京 100850;周长满 解放军北京高等医学专科学校

  关键词: 重组人白细胞介素-6;Bcl-2;海马神经元;培养细胞;免疫组化

  摘要 目的 观察重组人白细胞介素-6(rhIL-6)对体外培养大鼠海马神经元Bcl-2表达的影响。方法 取培养3、7、14、21和28天(d)的两组(对照组和rhIL-6组)培养神经元,分别观察其生长发育和神经元活存数,并用抗Bcl-2抗血清进行免疫组化染色,观察Bcl-2免疫反应(Bcl-2-IR)阳性和阴性神经元数目,计算Bcl-2-IR阳性神经元所占百分率,并在图像分析仪上对Bcl-2-IR神经元作平均光密度的色谱分析。结果 培养3、7、14、21和28 d时,rhIL-6组神经元活存数、Bcl-2-IR阳性神经元数和Bcl-2-IR阳性神经元的平均光密度均明显高于对照组。结论 rhIL-6能增强生长发育过程中海马神经元Bcl-2的表达,减少神经元的退化死亡,表明rhIL-6对体外培养的海马神经元具有神经营养作用。

  中图号 Q26 Q953 Q954.67

Effects of RhIL-6 on Bcl-2 Expression in Rat Hippocampal Neurons

Ding Aishi  Wang Fuzhuang  Fu Quenwu  Zhou Changman  Fan Ming

  (Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy Military Medical Sciences, Beijing 100850)

  Objective To study the effects of recombinant human interleukin-6(RhIL-6) on Bcl-2 expression in cultured hippocampal neurons.Methods The hippocampal neurons were immunocytochem stained using the antiserum of Bcl-2 in 3、7、14、21 and 28 day old cell. The number and the mean optical density of Bcl-2-immunoreactive(Bcl-2-IR) neurons were observed.Results The number and the mean optical density of Bcl-2-IR neurons were significantly increased with rhIL-6 in cultured hippocampal neurons.Conclusion RhIL-6 can increased Bcl-2 expression and decreased death of cultured hippocampal neurons in vitro. It suggested that rhIL-6 may act as a neurotrophic factor in the growth and development of hippocampal neurons.

  Key words recombinant human interleukin-6; Bcl-2; hippocampal neurons; cultured cell; immunohistochemical method

  近年研究表明,多数细胞都有程序性死亡(又称凋亡)的倾向,但在很多情况下,由于各种有利于生存因素的作用,使这种凋亡发生减少。迄今,在已知可抑制细胞凋亡的有关分子中,研究较多的是原癌基因蛋白Bcl-2。Bcl-2不但在淋巴系统表达,也在神经系统表达[1]。体外培养研究表明,在去除生存因子条件下,Bcl-2过度表达能延缓神经元死亡[2],Bcl-2基因移植在鼠神经系统过度表达使运动神经元的凋亡明显延缓[3]。本实验观察了体外培养大鼠海马神经元生长发育过程中Bcl-2的表达及细胞因子rhIL-6的影响。

  1 材料和方法

  1.1 海马神经元培养 按已有的细胞培养方法进行海马神经元培养[4],取新生的Wistar大鼠,在无菌条件下分离出双侧海马,用1.25g/L胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散并制成5×105/mL密度的细胞悬液,接种于涂有小牛皮胶的35mm塑料培养皿中,每皿2mL,置36℃、含10%CO2的培养箱(美国FORMA)内进行培养。培养液由体积分数为94% Eagle MEM、5%马血清和1% N3组合液组成。于培养第3 d在培养液中分别加入细胞分裂抑制剂阿糖胞苷3mg/L以抑制非神经细胞的过度增殖,作用48h后更换新鲜培养液,以后每周换液2次,每次更换半液。自细胞接种开始rhIL-6组细胞培养液内加入500U/mL rhIL-6(本所凌世淦教授提供的基因工程产品,电泳纯),并随着培养液的更换,即时加入相应量的rhIL-6,以维持作用浓度,同时设相应的对照组(不含rhIL-6)作平行观察。

  1.2 海马神经元生长和活存数的观察 每天定时用倒置相差显微镜观察两组培养神经元的生长发育,分别于培养3、7、14、21和28 d时在倒置相差显微镜(200×)下随机观察并计数50个相邻视野的活存神经元数作比较。

  1.3 培养神经元的Bcl-2免疫组化观察 分别取培养3、7、14、21和28 d的两组培养神经元,经40g/L多聚甲醛固定后,用抗Bcl-2抗血清(美国Santa Cruz公司产品)按1∶500稀释,并按ABC法进行免疫组化染色,用Ni-DAB-葡萄糖氧化酶系统显色。同时设替代对照(用正常羊血清替代第一抗体),在倒置相差显微镜(200×)下分别观察计数50个相邻视野中Bcl-2免疫反应(Bcl-2-IR)阳性和阴性神经元数目,计算Bcl-2-IR阳性神经元所占百分率。并作显微照相和在CMIAS真彩色病理图像分析仪(北京航天大学与空军总医院共同研制)上用光密度组件对Bcl-2-IR阳性神经元作平均光密度的色谱分析。

  2 结果

  2.1 rhIL-6对海马神经元生长发育的影响 新生大鼠海马神经元种植后6h,大部分神经元贴附在胶原生长面上,贴壁细胞呈圆形,尚未长出突起。培养10h后,两组神经元均有突起向外生长,但rhIL-6实验组细胞贴壁数和神经突起数均多于对照组。继续培养3、7、14、21和28 d时,实验组神经元活存数明显高于同时期对照组(表1)。

表1 rhIL-6对海马神经元活存数的影响

  Table 1 Effects of rhIL-6 on survival of hippocampal neurons (

Culture(t/d) Control(Number of neurons/fields) RhIL-6(Number of neurons/fields)
3 26.85±6.45 37.13±5.98**
7 20.98±4.70 32.03±3.86**
14 15.23±2.45 22.23±3.39**
21 9.70±1.76 16.05±2.34**
28 5.38±1.15 12.15±2.42**

  **P<0.01 compared with control2.2 rhIL-6对海马神经元Bcl-2表达的影响 经Bcl-2免疫组化显示,Bcl-2蛋白分布于神经元胞体内,染色为浅紫色。由图(A-H)可见,培养3、7、14和28 d时,rhIL-6组神经元Bcl-2免疫反应较对照组增强,Bcl-2免疫反应阳性神经元数明显高于同时期对照组(表2)。从Bcl-2免疫反应神经元阳性率比较看,在培养3、7、14 d时两组Bcl-2免疫反应神经元阳性率无明显变化,但在培养21和28 d时rhIL-6组Bcl-2免疫反应神经元阳性率显著高于对照组(表2)。图像分析的结果表明,在培养3、7、14、21和28 d时,rhIL-6组Bcl-2免疫反应阳性神经元的平均光密度均明显高于同时期对照组(表2)。

表2 rhIL-6对海马神经元Bcl-2表达的影响

  Table 2 Effects of rhIL-6 on Bcl-2 Expression of hippocampal neurons (

Culture

  (t/d)

Control rhIL-6
Bcl-2-IR

  number of

  neurons/fields

Positive

  rate(%)

Mean optical

  density of Bcl-

  2-IR neurons

Bcl-2-IR

  number of

  neurons/fields

Positive

  rate(%)

Mean optical

  density of Bcl-

  2-IR neurons

3 24.12±3.17 89.83±4.37 0.82±0.08 34.11±4.71** 91.87±2.69 1.13±0.09**
7 18.78±3.03 89.51±4.37 1.14±0.06 29.70±2.39** 92.73±2.07 1.35±0.09**
14 13.39±2.08 87.92±5.57 0.96±0.05 20.15±2.16** 90.64±3.13 1.16±0.06**
21 7.95±1.78 81.96±7.08 0.67±0.03 13.95±2.10** 86.92±3.53* 0.89±0.08**
28 3.75±1.12 69.71±9.04 0.63±0.04 10.24±1.84** 84.28±4.86** 0.70±0.03**

  *P<0.05 **P<0.01 compared with control

  附图 A、C、E、G:rhIL-6组海马神经元培养3、7、14和28 d时Bcl-2的表达;B,D,F,H:对照组海马神经元培养3、7、14和28 d时Bcl-2的表达

  Fig A,C,E,G:Bcl-2 expression of rat hippocampal neurons of rhIL-6 group were cultured for 3,7,14 and 28 days, respectively;B,D,F,H:Bcl-2 expression of rat hippocampal neurons of control group were cultured for 3,7,14 and 28 days, respectively

  3 讨论  近年来的研究认为,神经元死亡中除细胞坏死以外,还存在另一种细胞死亡形式——凋亡或程序性死亡(apoptosis or programmed cell death, PCD),即在某些生理或病理性因素诱导下,激活膜信号系统,进一步启动与调控细胞凋亡或程序死亡有关的基因,最终导致细胞按一定程序控制自我破坏和死亡。哺乳动物神经元死亡被认为是正常发育过程中一种普遍现象,由于神经元只能生长分化,不能分裂增殖,这一特点决定了保护神经元,挽救受损伤神经元有着重要意义。目前已知有数种基因参与细胞凋亡的调控,其中能抑制细胞凋亡的有Bcl-2基因,人体内的长寿细胞表达Bcl-2量较高,在大脑内的表达相当高[5],Bcl-2过量表达能延长神经元生存。Garcia等[6]将表达Bcl-2基因的质粒显微注入依赖生长因子的体外培养交感神经元,可预防去除神经生长因子诱发的神经元凋亡。Farlie等[7]用Bcl-2转基因小鼠进行实验,在没有神经生长因子存在的情况下,背根节感觉神经元仍能很好存活,在该动物模型上切断坐骨神经引起运动神经元凋亡明显延缓[3]。本实验用新生大鼠海马神经元进行分散培养,观察细胞因子rhIL-6对海马神经元生长发育和Bcl-2表达的影响,结果表明rhIL-6能增强生长发育过程中海马神经元Bcl-2的表达,减少神经元的退化死亡。目前已知IL-6参与中枢神经系统的免疫调节,它可刺激星形胶质细胞增殖,刺激星形胶质细胞分泌神经生长因子[8]。本实验结果证明,细胞因子rhIL-6有促进Bcl-2表达,抑制海马神经元凋亡的作用。其进一步的机制尚有待深入研究。

  △国家自然科学基金(39730190)资助;

  参考文献

  1 Castren E, Ohga Y, Berzaghi MP, et al. Bcl-2 messenger RNA is localized in neurons of the developing and adult rat brain. Neurosci, 1994, 61(1):165-177

  2 Allsopp TE, Wyatt S, Paterson FH, et al. The protooncogene bcl-2 can selectively rescue neurotrophic factor-dependent neurons from apoptosis. Cell, 1993, 73:295-307

  3 Dubois-Dauphin M, Frankowski H, Tsujimoto Y, et al. Neonatal motoneurons overexpressing the bcl-2 protooncogene in transgenic mice are protected from axotomy-induced cell death. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1994, 91:3309-3313

  4 丁爱石,王福庄.新生大鼠海马神经元在无血清培养基中的生长特性.细胞生物学杂志,1993,15(3):88-90

  5 Merry DE, Veis DJ, Hickey WF, et al. Bcl-2 protein expression is widespread in the developing nervous system and retained in the adult PNS. Development, 1994, 120(2):301-311

  6 Garcia I, Martinou I, Tsujimoto Y, et al. Prevention of programmed cell death of sympathetic neurons by the bcl-2 protooncogene. Science, 1992, 258:302-304

  7 Farlie PG, Dringen R, Rees SM, et al. Bcl-2 transgene, expression can protect neurons against developmental and induced cell death. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1995,92:4397-4401

  8 Norris JG and Benveniste EN. Interleukin-6 production by astrocytes: Induction by the neurotransmitter norepinephrine. J Neuroimmunol, 1993, 45:137-145

(1998-03-13收稿)


作者: 风清扬 2009-2-21
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具