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1995年大连麻疹病毒流行株的部分基因分析
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 病毒学
作者：葛力 JIN Li 邵燕 王稳 高学谦 王晓琴
单位：葛力 邵燕 王稳 高学谦 王晓琴（116021 大连市卫生防疫站）；JIN Li （Central Public Health Laboratory, the U.K.）
关键词：聚合酶链反应；麻疹病毒；基因，；病毒；核蛋白类；基因型
【 摘要 】 目的 本实验以研究麻疹病毒(MV)为目的, 采用反转录聚合酶链式反应(RT PCR), 早期、快速、准确、灵敏地检出MV, 通过对扩增产物的基因分析, 判断传染源和传播途径, 并研究MV基因型。方法 对1995年6月大连地区发生的一起5人的麻疹流行进行MV检测, 用反转录套式PCR法分别扩增MV的核蛋白基因(N)和基质蛋白基因(M)，阳性对照用长春冻干麻疹活疫苗。对疫苗株长-47(9405)和任意选取的两个标本DL1China95、DL2China95的扩增片段进行核酸序列测定，并对核酸序列、相应的氨基酸序列及基因差异进行计算机分析。结果 疫苗株和患者标本均扩增得到N基因318nt, M基因188nt核酸片段, 确证此次为麻疹流行。DL1China95、DL2China95有完全相同的核酸序列，属同一流行株，说明此次麻疹流行来自同一传染源，此结果与流行病调查结果相符。此流行株不同于疫苗株长-47(9405)。M基因的152nt中，流行株5nt不同于疫苗株，其中有义突变2nt。N基因的变异较大，在282nt中，流行株有21nt不同于疫苗株，其中有义突变12nt。依据N基因1235～1516核酸序列, 此流行株的基因型分析结果与非洲、欧洲以及美国近年的流行株明显不同, 差别为(7.4～12.8)%。结论 MV的基因型分析有助于研究MV的流行规律，更好地进行疾病监测。
Partial genetic analysis of a measles virus strain epidemiced in 1995 in Dalian GE Li, JIN Li, SHAO Yan, et al. Dalian Anti-epidemic Station, Dalian 116021
【 Abstract 】 Objective To explore the source and path of measles infection by genotype analysis with RT-PCR.Methods There were 5 people suffered from clinical measles in June 1995 in Dalian，China. The virus strains were isolated and the Matrix(M) gene and Nucleocapsid(N) gene were amplified by RT-PCR. Changchun measles vaccine strain〔Chang-47(9405)〕 was used as positive control. PCR products of two random clinical samples DL1China95, DL2China95 and vaccine strain Chang-47(9405) were sequenced. Nucleic sequence, amino acid sequence and gene difference were analyzed by computer.Results 318nts fragment of N gene and 188nts fragment of M gene were amplified from the vaccine virus and the specimens. That confirmed that the cases were caused by MV. The sequences of DL1China95 and DL2China95 were identical in both of the M gene and the N gene. That suggested that the outbreak was originated from a single MV strain. This conclusion was the same as that of epidemiological investigation. The sequences of DL1China95 and DL2China95 were notably different from that of Chang-47(9405). Among the 152nts of the amplified fragment of M gene, there were different 5nts between DL1China95 and Chang-47(9405). Among the 282nts of the amplified fragment of N gene, there were different 21nts between DL1China95 and Chang-47(9405). The epidemic strain was different from the strains widespread in the Africa, Europe and USA. The divergence of the 1 235-1 516 N gene fragment between DL1China95 and other strains was (7.4-12.8)%.Conclusions The genotype analysis of measles is helpful for studying epidemic regularity and doing better surveillance programs.
【 Subject words 】 Polymerase chain reaction Measles virus Gene,viral Matrix gene Nucleocapsid gene Genotype
麻疹病毒（MV）是一种重要的人类致病病毒，可引起发热，呼吸道卡他与出疹为主的急性病毒性传染病。自从疫苗应用以来，麻疹疫情得到控制。但每年在全球仍有散发患者，并在一定范围内造成流行，引起近百万人死亡。由于疫苗的应用，患者的临床症状不典型，需实验室检验结果加以证实。而传统的病毒分离、抗原检测和血清学方法有其局限性。用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法可以早期、快速、灵敏、准确地检出MV，为判断麻疹的发生、流行提供明确的依据。 MV只有一种血清型，但近年对麻疹基因的分析发现，MV有几种基因型〔1-3〕，在不同地区和时间流行株的基因型不同，对MV基因型可以进行病原学分析，判断传染源和传播途径。
材料与方法
1. 标本来源：1995年6月，大连地区发生一起在外来人员中小范围的麻疹流行。5位患者为17～20岁的青年，均有发热，呼吸道卡他，斑丘疹等较典型的临床症状，临床诊断为麻疹。血清学ELISA法检测麻疹特异抗体IgM，4人为阳性，1人为可疑阳性。采集咽拭子置于2ml 0.8%盐水中用于RT-PCR检测。
2. 标本处理： 咽拭子于2ml盐水中反复挤压后弃去, 4000r/min离心后弃上清, 沉淀中加入50μl裂解缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl, pH8.5; 1mmol/L EDTA-Na2, 0.5% Tween-20, 使用时加蛋白酶K至100μg/μl)，37℃过夜，95℃ 10分钟灭活蛋白酶K，分别取10μl 裂解液置于2管中用于M、N 基因的反转录和扩增。阳性对照用长春冻干麻疹活疫苗(批号9405-302)，用0.8%盐水稀释成病毒量为3.5TCID50/ml ，取10μl用于反应。阴性对照用0.8%盐水10μl，同法裂解。
3. 反转录PCR：核蛋白基因(N)引物：Mn1 (+) (1304～1323), Mn2R (-) (1694～1676), Mn3(+) (1324～1341),Mn4R (-) (1641～1624)，基质蛋白基因(M)引物 Mm1 (+) (3541～3560)，Mm2R (-) (3740～3721)，Mm3 (+) (3549～3560)，Mm4R (-) (3736～3719)〔1〕。
(1) M基因反转录, 取裂解液10μl, 加入5μl 10×PCR 缓冲液(50mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2, 100mmol/L Tris-HCl, pH8.3, 0.01% 明胶)， 10mmol dNTPs(华美), 7.5U RTase (Promega), 40U RNasin (华美)， 5pmol Mm1 , 加水至总体积50μl, 室温放置10分钟后，37℃水浴60分钟, 100℃放置5分钟, 0℃放置3分钟, 做一步PCR。
(2) 反转录产物10μl, 加入5pmol引物Mm2R, 2U Taq酶(华美)，补充10×PCR缓冲液，加水至总体积50μl, 离心后，加一滴石蜡油， 95℃预变性2分钟后，94℃ 1分钟, 50℃ 1分钟, 72℃ 1分钟, 循环25周后，37℃延伸5分钟。产物为201bp片段。
(3) 一步PCR产物2μl, 加入引物Mm3，Mm4R各25pmol，10mmol dNTPs，2U Taq酶，10× PCR缓冲液，加水至总体积50μl，离心后，加一滴石蜡油， 95℃预变性2分钟后，94℃ 1分钟, 50℃ 1分钟, 72℃ 1分钟, 循环25周后，37℃延伸5分钟。产物为188bp片段。
(4) 用Mn1、Mn2R、Mn3、Mn4R 分别代替Mm1、Mm2R、Mm3、Mm4R扩增N基因， 一步PCR产物为391bp片段, 二步PCR产物为318bp片段。
4. 电泳：将M、N基因二步PCR 产物加样于1%琼脂糖凝胶，电泳后，紫外灯下观察电泳结果。
5. 核酸序列的测定：对疫苗株长-47(9405)和任意选取的两个标本DL1China95、DL2China95在凝胶中的扩增片段进行回收纯化处理, 然后用Taq DyeDeoxy Terminator cycle sequencing 测序盒(Applied Biosystems Ltd. UK)，以Mn3、Mn4R、Mm3、Mm4R为引物，用全自动序列分析仪正反向测序。
6. 计算机分析：采用SeqEd.V1.0.3程序对核酸序列相应的氨基酸序列及基因差异进行计算机分析。采用 DNASTAR软件Megalign 程序，依据N基因1235～1516 nt 核酸序列差异做序列系统树。
结 果
1. 用RT-PCR法，疫苗株和患者标本均扩增得到N基因318bp、M基因188bp核酸片段。阴性对照则无此片段(照片略)。
2.对疫苗株和两个标本的M基因152nt的核酸序列测定结果如图1。N基因282nt的核酸序列测定结果如图2。依据N基因1235～1516核酸序列, 此流行株、疫苗株与以前的36株MV(共39株)做序列系统树如图3。 此流行株明显不同于以前的流行株的基因型A、B、C、D、E、F、G〔1，2〕, 属于一新的基因型。DL1China95的N基因1235～1516核酸序列与世界其它地区流行株的差别为 (7.4～12.8)%。
图1 长春疫苗株长-47(9405)与流行株DL1China95,DL2China95的M基因152nt区域核酸、氨基酸序列比较(只标出差异，说明参见图2)
Fig 1. Sequence comparison of a 152nt region of the M gene among the vaccine strain Chang-47(9405) and epidemic strains DL1China95,DL2China95(only the differenc are shown，refer to Fig.2)
图2 长春疫苗株长-47(9405)与流行株DL1China95、DL2China95的N基因C-末端282nt区域核酸、氨基酸序列比较(只标出差异)
Fig 2. Sequence comparison of a 282nt region of the C-terminal N gene between the vaccine strain Chang-47(9405) and epidemic strains DL1China95, DL2China95(only the difference are shown)
nt position refer to the sequence of the Edmonston strain
1.nt sequence of Chang-47(9405), 2.aa sequence of Chang-47(9405), 3.aa sequence of DL1China95, 4.nt sequence of DL1China95, 5.nt sequence of DL2China95
图3 依据N基因1235～1516核酸序列，此流行株与世界其它地区流行株及疫苗株的序列系统树分析，基因型比较
Fig 3. Phylogenetic analysis of this epidemic strains and other genotypes based on the nucleotide sequence 1235～1516 of the N gene
3.从图1、图2可见，DL1China95、DL2China
95有完全相同的核酸序列，属同一流行株。此流行株不同于疫苗株长-47(9405)。M基因的152nt中，流行株5nt不同于疫苗株，其中有义突变2nt。265nt 处A→G，267nt处A→G，引起氨基酸改变，K+→E-。N基因的变异较大，在282nt中，流行株有21nt不同于疫苗株。其中有义突变12nt，引起编码的94个氨基酸中的11个发生变化，占11.6％。其中1292nt处A→G，引起氨基酸改变，R+→G; 1422nt处C→A，引起氨基酸改变，A→D-。
讨 论
据报道，1991～1994年，国内麻疹流行出现小高峰，成人发病则多见于暴发流行区〔4〕。大连地区流行滞后，发病率于1993～1995年出现小高峰，患者以儿童为主。本次麻疹流行发生在外来2～3个月的大年龄组青年中，5人的免疫接种史不详，发病前一个月无外出史。5人都有较典型的临床症状。血清学IgM检测，4例为阳性，1例为可疑阳性。用RT-PCR法，均扩增到麻疹特异的核酸片段。确证此次为麻疹流行，核酸序列相同，说明为同一传染源，是患者间相互接触传播的，流行病调查结果证实患者平时接触频繁。
对MV的研究表明，N基因编码的产物C末端是高变区〔2，3〕，故设计引物扩增片段在高变区侧翼的相对保守区，以确保得到扩增产物，并研究其变异性。M基因的变异性比N基因要小，M基因引物扩增的是一段保守区的相对易变序列。从任意选取的两个患者的RT-PCR产物序列测定表明（图1、图2)，两株MV, DL1China95,DL2China95有完全相同的核酸序列，此次的流行株明显不同于疫苗株。其中N基因编码的两个氨基酸R+→G，A→D-带电性改变(见结果3)，可能直接影响到蛋白质的高级结构, 而氨基酸457～476(nt1370～1429) 是B细胞表型位点〔5〕，此区段中的氨基酸的变化可能引起抗原性变异。
研究发现，虽然MV只有一种血清型，但可分为不同的基因型〔1-3〕。流行病学研究表明，在病原体的分型上，基因型与表型相比，有更直接、更稳定、分辨率更高的特点〔6〕。虽然MV基因分型没有固定模式，但M、N基因分型基本一致〔3〕。从分型结果看（图3)，此次流行株明显不同于类似Edmonston 株的长春疫苗株，不同于非洲、欧洲及美国流行株，属于一新的基因型，与其它已知基因型的差异很大。MV的基因型分析有助于研究MV的流行规律，更好地进行疾病监测。
参考文献
[1] Jin L, Richards A,Brown, DWG. Development of a dual target-PCR for detection and Characterization of measles virus in clinical specimens. Molecular and cellular Probes, 1996, 10∶191-200.
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收稿：1997-08-11 修回：1998-06-10)