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双歧杆菌表面分子对LPS在小鼠体内调节胸腺细胞凋亡的观察
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 细菌学
作者：余振东 胡宏
单位：余振东 430022武汉，同济医科大学附属协和医院检验科；胡宏 重庆医科大学检验系
关键词：双歧杆菌；表面分子；脂多糖；细胞凋亡；胸腺细胞
【 摘要 】 目的 研究双歧杆菌表面分子细胞壁肽聚糖（WPG）、脂磷壁酸（LTA）对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的调节。方法 用DNA凝胶电泳、TUNEL法检测WPG、LTA对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的影响，并分别用生物活性法和Griess反应测定WPG、LTA、LPS体外诱生TNF-α、NO2-的含量。结果 WPG、LTA可显著抑制LPS体内诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡。WPG、LTA单独刺激巨噬细胞时所诱生的TNF-α、NO的量显著低于LPS刺激时所产生的这两种活性介质的量，而WPG、LTA与LPS共同应用时可显著降低LPS诱导巨噬细胞产生的TNF-α、NO的量；诱生型一氧化氮合成酶抑制剂S-甲基异硫脲硫酸盐体外可抑制巨噬细胞产生的NO的量，在体内可部分抑制LPS诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡。结论 WPG、LTA与LPS共同应用时，可抑制LPS诱导的巨噬细胞产生的TNF-α、NO的量，从而下调LPS体内诱导小鼠胸腺细胞的凋亡。
Regulation of Bifidobacterium bifidum surface molecules on apoptosis of murine thymocytes induced by LPS in vivo
YU Zhendong, HU Hong. Clinical Laboratory of Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
【 Abstract 】 Objective To investigate the regulation of Bifidobacterium bifidum surface molecules-whole peptidoglycan (WPG), lipoteichoic acid (LTA) on apoptosis of murine thymocytes induced by LPS in vivo.Methods Apoptosis of murine thymocytes in the cortex in vivo was analysed with methods of DNA gel electrophoresis and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL).Results in vivo, the induction of apoptosis in murine thymocytes by LPS was significantly inhibited by WPG and LTA. in vitro, LPS induced significantly more TNF-α and NO which released from murine macrophages than all of the tested surface molecules did. When WPG and LTA were combined with LPS respectively in stimulating murine macrophages, TNF-α and NO release significantly decreased compared with that induced by LPS alone. SMT, a selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase, not only decreased NO activity in murine macrophages induced by LPS in vitro,but also inhibited apoptosis of murine thymocytes induced by LPS in vivo.Conclusion The results suggest that WPG and LTA reduce LPS-stimulated TNF-α and NO release, then down-regulate apoptosis of murine thymocytes induced by LPS in vivo.
【 Subject words 】 Bifidobacterium bifidum Surface molecules Lipopolysaccharide Apoptosis Thymocytes
双歧杆菌及其表面分子脂磷壁酸（LTA）、细胞壁肽聚糖（WPG）已广泛用于抗感染、抗肿瘤、免疫调节等〔1，2〕的研究，尚未发现其在机体的应用中有任何毒副作用。近年来，许多学者对LPS诱导细胞凋亡的作用机理进行了大量研究，并探讨大分子物质及药物对LPS等诱导细胞凋亡的调节作用〔3～5〕。由于WPG、LTA与LPS除致毒死性和致热原性等作用外，某些生物学活性相似，因此，我们观察了双歧杆菌表面分子WPG、LTA对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的调节。
材料与方法
1. 菌种及主要试剂：①菌种：分叉双歧杆菌（Bif1101)，本室分离，经中国科学院微生物研究所鉴定。用BL肉汤37℃厌氧培养48小时、65℃ 45分钟杀死细菌，备用。②LPS：E.coli.O111 9604北京邦定公司；③LTA：按Sutcliffe等〔6〕方法本室自制，-20℃保存；④WPG：按文献〔7〕方法自制，-20℃保存；⑤细胞凋亡检测试剂盒（TUNEL法，德国宝灵曼）。
2. 实验动物：用于DNA凝胶电泳：4～5周龄BALB/c小鼠,雌雄各半，16～18g，由重庆医科大学实验动物中心提供，随机分8组，每组2只，各组均采用腹腔内注射。18小时后断颈处死小鼠取胸腺作DNA凝胶电泳。用于TUNEL法检测：动物条件同上。前4组每组5只，各组均采用腹腔内注射。18小时后断颈处死小鼠,取胸腺作组织切片，以TUNEL法观察细胞凋亡的特征。
3.实验方法
(1) 小鼠胸腺细胞凋亡用DNA凝胶电泳检测，按参考文献〔8〕进行。 小鼠胸腺组织切片组织原位标记检查（TUNEL法）按参考文献〔9〕方法进行。小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养，按参考文献〔10〕方法进行。
(2) TNF-α的诱生：将含10%新生小牛血清的RPMI 1640配成的巨噬细胞（106/ml）加到24孔板，每孔0.5ml，然后按分组加入不同浓度的刺激物，每浓度设4个复孔，并设阴性对照。混匀，37℃ 5% CO2培养8小时，取上清作TNF-α活性测定，按杨贵贞等〔11〕的方法进行。
(3) NO的诱生：将以10%新生小牛血清的DMEM配成的巨噬细胞（106/ml）加入24孔板，每孔0.5ml，然后按分组加入不同浓度的刺激物，每浓度设5个复孔，并设阴性对照。混匀，37℃ 5% CO2培养24小时，取上清作NO2-测定，按Holub等〔12〕的方法进行。
(4) SMT对LPS诱生NO的抑制作用：将10%新生小牛血清的DMEM配成的巨噬细胞（106/ml）加入24孔板，每孔0.5ml，加入不同浓度SMT，每浓度设2个复孔，并设阴性对照，处理组每孔均加入LPS至终浓度为100ng/ml，混匀，37℃ 5% CO2培养24小时，取上清作NO2-含量测定。
(5) 统计学处理：采用完全随机设计的方差分析，组与组间比较用q检验。
结果
1. 双歧杆菌全菌（Bif 1101）及WPG、LTA对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞DNA片段化的调节：见图1、图2。高剂量（100μg/只）的WPG、LTA对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞DNA片段化有明显的抑制作用，而低剂量（10μg/只）的WPG、LTA及双歧杆菌全菌这种作用则不明显。WPG、LTA及双歧杆菌全菌单独注射小鼠，不能引起胸腺细胞DNA片段化。
图1 双歧杆菌全菌及WPG、LTA对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞DNA片段化的调节
Fig 1. Regulation of Bif 1101，WPG，LTA on DNA fragmentation of murine thymocytes induced by LPS in vivo
1:WPG 100μg+LPS 50μg; 2:LTA 100μg+LPS 50μg; 3:Positive control (LPS 50μg); 4:Bif 1101 100μg+ LPS 50μg; 5:NS control; 6:WPG 10μg+LPS 50μg. 7:LTA 10μg+LPS 50μg;
图2 WPG，LTA及双歧杆菌全菌分别注射小鼠，胸腺细胞DNA凝胶电泳
Fig 2. DNA gel electrophoresis of murine thymocytes treated respectively with WPG，LTA and Bif 1101 in vivo
1:Bif 1101 100μg; 2:LTA 100μg; 3:WPG 100μg; 4:NS control
2.WPG、LTA及SMT对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的影响：由表1可见WPG、LTA可显著下调LPS体内诱导小鼠胸腺细胞的凋亡（P＜0.01），10-3mol SMT可显著抑制LPS体内诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡（P＜0.01）。
表1 WPG、LTA及SMT对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的影响
Table 1.Effect of WPG，LTA and SMT on apoptosis of murine thymocytes induced by LPS in vivo
| Group | n | Percent of apoptotic
thymocytes( |
| NS control | 5 | 1.11±0.33 |
| LPS 50μg | 5 | 61.30±4.13 |
| LPS 50μg+WPG 100μg | 5 | 15.34±1.36* |
| LPS 50μg+LTA 100μg | 5 | 12.81±1.31* |
| LPS 50μg+SMT 10-3mol | 5 | 24.87±2.58* |
| LPS 50μg+SMT 10-5mol | 5 | 61.12±3.07 |
* P＜0.01 compared with LPS 50μg group
3.WPG、LTA对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α活性的影响：见表2，两种浓度的WPG、LTA可显著抑制LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF-α的量（P＜0.01），且两种浓度的抑制作用存在显著差别（P＜0.01）。
表2 WPG、LTA对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α活性的影响
Table 2. Effect of WPG，LTA on TNF-α activity from murine macrophages induced by LPS in vitro
| Group(n=4) | TNF-α ( |
| NS control | 2.50± 0.71 |
| LPS 100ng/ml | 357.50±11.90 |
| WPG 50μg/ml | 36.25± 3.22* |
| LTA 50μg/ml | 52.50± 3.53* |
| LPS 100ng/ml+WPG 50μg/ml | 87.50± 6.45*△ |
| LPS 100ng/ml+WPG 10μg/ml | 243.57±11.08* |
| LPS 100ng/ml+LTA 50μg/ml | 61.87± 4.73*△ |
| LPS 100ng/ml+LTA 10μg/ml | 208.75± 8.54* |
* P＜0.01 compared with LPS 100ng/ml group, △P＜0.01 compared with another concentration
4.WPG、LTA对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO-2含量的影响：见表3。不同浓度的WPG、LTA可显著抑制LPS诱导的腹腔巨噬细胞产生的NO-2含量（P＜0.01），且两种浓度的抑制作用存在显著差别（P＜0.01）。
表3 WPG、LTA对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO-2活性的影响
Table 3.Effect of WPG，LTA on NO-2 concentration from murine macrophages induced by LPS in vitro
| Group(n=5) | NO2- ( |
| NS control | 0.28±0.09 |
| LPS 100ng/ml | 32.01±1.64 |
| WPG 50μg/ml | 30.2±0.17* |
| LTA 50μg/ml | 1.22±0.15* |
| LPS 100ng/ml+WPG 50μg/ml | 16.40±0.95*△ |
| LPS 100ng/ml+WPG 10μg/ml | 27.66±0.48* |
| LPS 100ng/ml+LTA 50μg/ml | 5.78±0.35*△ |
| LPS 100ng/ml+LTA 10μg/ml | 22.34±1.04* |
* P＜0.01 compared with LPS100ng/ml group, △P＜0.01 compared with another concentration
5.SMT对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO-2含量的影响：见表4。SMT可抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞产生NO-2的含量，且抑制强度与SMT呈剂量依赖关系。
表4 SMT对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO-2含量的影响
Fig 4. Effect of SMT on NO-2 concentration from murine thymocytes induced by LPS in vitro
| Group(n=2) | NO-2 ( |
| NS control | 0.26±0.11 |
| LPS 100ng/ml | 32.01±1.64 |
| LPS 100ng/ml+SMT(10-6mol/L) | 29.89±0.46 |
| LPS 100ng/ml+SMT(10-5mol/L) | 18.62±1.81 |
| LPS 100ng/ml+SMT(10-4mol/L) | 5.54±0.59 |
| LPS 100ng/ml+SMT(10-3mol/L) | 2.90±0.52 |
| LPS 100ng/ml+SMT(10-2mol/L) | 2.31±0.44 |
讨论
近年来研究表明，LPS可体内诱导胸腺细胞发生凋亡〔8〕。随着对胸腺细胞凋亡的深入研究，学者们已发现诸多因素，如胸腺微环境中基质细胞〔13〕、某些药物〔3〕、激素〔4〕及细胞因子〔5〕等对胸腺细胞凋亡具有调节作用。LPS诱导胸腺细胞凋亡的分子生物学机制，有学者认为LPS能诱导巨噬细胞产生大量TNF-α、NO等活性介质〔12〕，而TNF-α可诱导多种细胞发生凋亡〔14〕。我们探讨了WPG、LTA对LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的影响，结果发现，WPG、LTA可明显抑制LPS诱导的胸腺细胞DNA片段化，并且这种抑制作用与WPG、LTA呈剂量依赖关系，我们用TUNEL法检测表明，WPG、LTA分别与LPS共同注射小鼠，可显著降低胸腺皮质部分凋亡细胞的百分率。
双歧杆菌在维持机体的健康过程中起重要的作用，这些作用包括：生物学屏障，控制内毒素血症、预防和治疗细菌性腹泻，抗肿瘤、抗感染等〔1，2〕。双歧杆菌的免疫调节作用贯穿于以上各种作用的机理中，有研究表明，双歧杆菌及其表面分子WPG、LTA能增强腹腔巨噬细胞来源的细胞因子IL-1、TNF、IL-6等的活性，从而激活免疫系统。双歧杆菌作为益生菌，在机体中产生适量的生物活性介质。我们在实验中发现，WPG、LTA单独使用使小鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF-α、NO的量显著低于LPS所诱生的这两种活性介质的量。由于LPS与PG、LTA均为细胞壁成分，它们在外周血单个核细胞及巨噬细胞等上有相同的竞争性结合位点〔15〕。因此它们可能通过相同的途径激活单个核细胞或巨噬细胞从而产生相应的活性介质。SMT是诱生型NO合成酶的选择性抑制剂，我们还观察到，SMT不仅可抑制LPS体外诱导巨噬细胞产生的NO的量，而且与LPS一起腹腔注射小鼠还可部分抑制小鼠胸腺细胞的凋亡。因此，我们推测WPG、LTA可下调LPS体内诱导小鼠胸腺细胞凋亡的机制是由于WPG、LTA与LPS同时注射小鼠时，可能与LPS竞争巨噬细胞上的结合位点，从而使巨噬细胞产生的TNF-α、NO的量显著下降，降低这两种活性介质作用的强度，使胸腺细胞凋亡的数量显著下降。
本课题受国家自然科学基金资助(批准号39570010)
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(收稿：1997-12-08 修回：1998-10-12)