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HPV16型E7C亚基因与共激活分子B7-1协同诱导E7特异性CTL研究
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 基础免疫学
作者：徐建青 司静懿 张友会 宋国兴 刘世德 许雪梅 宋韬
单位：徐建青 司静懿 宋国兴 刘世德 许雪梅 宋韬 100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所，中国协和医科大学基础医学研究院；张友会 中国医学科学院肿瘤所
关键词：乳头瘤状病毒；人；E7C亚基因；T淋巴细胞；细胞毒性；DNA疫苗
【 摘要 】 目的 利用去除E7的转化活性而保留其抗原性的E7C亚基因研制防治HPV16相关疾病的疫苗，并进一步探索利用B7-1研制更佳活化细胞免疫的加强疫苗。方法 用PCR方法扩增获得E7C后，插入真核表达质粒获得pLNCE7C，体外真核细胞中证实其具有表达能力后，在C57BL/6小鼠后腿肌肉内直接进行裸DNA接种免疫，或与pLNCmB7-1联合免疫接种，用51Cr释放法体外分析经免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性。结果 经免疫小鼠获得较好的E7特异性CTL活性；若E7C与小鼠B7-1的表达质粒联合接种，则活性明显得到加强。结论 E7C可以用于HPV16 DNA疫苗研制，B7-1具有推广应用价值。
Human Papillomavirus 16 E7-specific CTL Induction through Mouse B7-1 Costimulating with E7C Subgene
XU Jianqing SI Jingyi ZHANG Youhui et al. *Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences.Beijing,100005【 Abstract 】 Objectives To develop a prophylactic and therapeutic vaccine against HPV16 with the E7C subgene possessing the antigenicity of E7 and no transformational activity, and trying to explore more active vaccine for inducing cellular immunity with B7-1.Methods In these experiments, the E7C was amplified by PCR and then inserted into eukaryotic expression plasmid for constructing pLNCE7C. Being confirmed the ability to express in eukaryotic cells in vitro, the pLNCE7C plasmid alone or associated with mouse B7-1 was inoculated directly into the muscles on the posterior leg of C57BL/6 mice , the activity of cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from the immunized mice were analyzed in vitro with 51 Cr specific release assay.Results The CTLs from immunized mice were activated efficaciously by naked E7-expression plasmid ; higher activity of CTL could be produced by B7-1 synergizing with E7C through immunizing with the mixture of both expressing plasmids.Conclusions E7C subgene is proved suitable for developing DNA vaccine, and the B7-1 is worthy for exploiting widely.
【 Subject Words 】 Human papillomavirus 16 E7C subgene T lymphocyte，cytotoxic Mouse B7-1 DNA vaccine
人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus 16, HPV16)是重要的感染因子，可致性传播疾病，并被确定为宫颈癌前病变及宫颈癌的启动因子。研制防治HPV16相关疾病的疫苗是这一领域热点。由于E7在相关病变组织中构成性表达并具有很强的抗原性，因而被首选用来制备疫苗。但其作为HPV16的主要转化基因，又排除直接用作疫苗的可能；最近的人群血清学调查及动物试验研究表明：E7的抗原表位主要集中在C端；而与其转化活性直接相关的区域是E7N端 (包括Rb蛋白结合位点22～26位氨基酸和CKII识别位点31～38位氨基酸)。所以，利用E7C亚基因研制DNA疫苗是较理想的选择。E7在病变组织中的表达(尤其是在肿瘤组织中的表达)并非一定引起该组织被机体排除，因而，制备疫苗(尤其是治疗疫苗)尚需更为有效的途径来克服机体的免疫忽视状态。近年来，对T淋巴细胞的激活机制研究表明，有效活化T淋巴细胞需要双信号：第一信号由与APC MHC分子结合的特异性抗原肽与TCR结合提供，第二信号由APC的共激活分子与T细胞表面的相应受体结合提供。B7家族是最受重视的共激活分子，其作用得到普遍的肯定。本研究利用小鼠B7-1与E7C基因混合在肌肉内直接注射，观察协同诱导特异性CTL的效果。
材料与方法
1.质粒：pJ4ΩE7表达质粒:由英国剑桥大学Margaret教授惠赠，含HPV16E7全基因编码序列及E1N端1.6kb序列(图1-1)。pLNCX质粒：由本所生化室提供(图1-2)。pLNCmB7-1表达质粒 (图1-3)：由本室自行构建，含小鼠B7-1全编码序列920bp。
图1 实验用质粒图
2. E7C端扩增引物：由本室设计并合成，其序列为：
引物中除引入一个用于鉴定克隆方向的酶切位点外，在上游引物中尚附加了与表达有关的序列元件。
3.B16细胞系：为C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞系。
4. PCR扩增: 应用上述引物以pJ4ΩE7为模板进行常规PCR扩增。
5. 真核表达载体的构建与酶切鉴定:E7C的PCR产物利用平端连接插入pLNCX载体中，经BamHⅠ酶切鉴定插入方向。
6. B16细胞的转染与免疫组化检测E7C基因的表达：小量制备的pLNCE7C质粒经PEG纯化，75％酒精消毒后，无菌超净台中晾干备用；细胞转染方法按GIBCO公司Lipofectamine试剂使用说明书进行。 转染后细胞在浓度为600μg/ml的G418(GIBCO产品)中进行筛选，挑取抗性克隆扩增并进行Southern杂交，阳性克隆利用E7多抗(英国剑桥大学张卫博士惠赠)免疫组化法检测E7C的表达。
7.动物实验
(1) 质粒DNA的制备：动物接种所用的质粒包括pLNCE7C、pLNCB7均经如下处理：大量制备所获质粒→两次CsCl纯化→最后无菌PBS重溶，终浓度为1μg/μl。
(2) 裸DNA动物接种：肌肉内接种〔1〕。取雌性、5～6周C57BL/6小鼠，按750μg/10g体重腹腔麻醉小鼠。尔后，在小鼠右小腿后肌去毛备皮，用1ml针管吸取0.1ml 25%蔗糖/PBS溶液，垂直注射入肌内 (针头前端用一橡皮块阻挡，使针头仅露针尖斜面)，间隙进行局部按摩，30分钟后，在已经肿胀的肌肉内垂直注入50μl (含50μg质粒DNA)质粒溶液，注射用针与前相同，注射时较缓慢，注射完毕稍按摩后再拔出针头。
各组均间隔10天加强接种一次，共加强接种二次；最后一次加强免疫2周后取脾细胞做CTL活性检测。
8. CTL体外杀伤活性测定
(1)CTL体外刺激〔2〕：常规制备免疫鼠脾细胞悬液。另制备健康未免疫同系小鼠脾细胞悬液，以MMC 80μg/ml 37℃处理1小时，洗3次，再与相应肽(2μg/106细胞)于37℃孵育2小时，作为刺激细胞。免疫鼠脾细胞〔(5～6)×106细胞/ml〕与刺激细胞〔(2～3)×106细胞/ml〕混合，并加入rIL-2(终浓度20U/ml),于24孔细胞培养板(2ml/孔)，37℃ 5％ CO2培养5天，然后做CTL细胞毒活性测定。
(2)CTL细胞毒活性测定
靶细胞：RMA-S细胞，来源于C57BL/6小鼠，为Rauscher病毒诱生的T淋巴细胞RBL-5细胞的突变株。
P49-57-pulsed RMA-S:P49-57肽标记的RMA-S细胞，肽的序列为RAHYNIVTF，赛百盛公司合成。
靶细胞用Na2 51CrO4 ( 购于杜邦公司 )按100μCi(3 700kBq)/106细胞于37℃标记1小时。对于P49-57-pulsed RMA-S细胞，在51Cr标记的同时加入相应的肽100μg/106细胞。标记好的细胞洗4次，调整浓度为105细胞/ml。
效应细胞：收获在体外经肽刺激5天的CTL，用Ficoll(密度为1.077)离心，除去死细胞。活细胞从106细胞/ml 作连续4个梯度的稀释接种于96孔U形底培养板，100μl/孔，每种浓度接种3孔。
将100μl靶细胞(104细胞)/孔加入预先已接种效应细胞的96孔培养板中，形成不同的效∶靶比(E∶T), 同时做自然释放对照(单纯靶细胞与培养基)和最大释放对照(单纯靶细胞加100μl 1% SDS), 37℃ 5％ CO2条件下作用6小时，1500转/分 离心5分钟，小心吸取100μl上清，γ计数仪读取cpm值。按以下公式计算杀伤率：
结果
1. E7C的PCR扩增：以pJ4ΩE7为模板，利用上述引物进行PCR扩增E7的39～98氨基酸的编码序列，获得的片段为210bp(见图2)。
图2 PCR扩增获得HPV16E7C端
Fig 2.Amplification of HPV16 E7C by PCR
2. pLNCE7C质粒构建：所获得的E7C片段经补平后，插入到pLNCX载体的多克隆位点，获得pLNCE7C表达质粒；pLNCX载体仅有单一BamHⅠ酶切位点；E7C片段中亦为单一BamHⅠ切点，位于5'端，故可用BamHⅠ酶切鉴定插入方向，若正向插入，经BamH Ⅰ 酶切获得820bp带；反之，可切出1 020bp片段; 根据切出的片段与pBR322/BstNⅠ marker 中929bp片段的前后关系可判断插入方向。若用HindⅢ 和ClaⅠ双酶切则可切出200bp片段。图3(a)中显示，双酶切出的泳带位于383bp marker带的前面，由于量少，带极微弱(见泳道1)；而图3(b)中用BamHⅠ切出的泳带位于929bp marker泳带的前端，且紧靠此带(见泳道2)；结果判断获得正向插入克隆(所构建pLNCE7C见图4)。
图3 pLNCE7C质粒的酶切鉴定
Fig 3.Identification of plasmid pLNCE7C by Gel analysis of digested product
a. 1: pLNCE7C cleaved by HindIII and ClaⅠ, 2: pBR322/HinfⅠ marker
b. 1: pBR322/BstNⅠ marker，2: pLNCE7C digested by BamHⅠ，3: pBR322/HinfⅠ marker
图4 所构建的pLNCE7C质粒
Fig 4. Plasmid pLNCE7C
3. E7C的表达鉴定：将所获得的G418抗性细胞接种至事先放置处理的0.5×0.5cm2盖玻片的24孔板，待细胞长至（50～60）％，取出，做免疫组织化学检测（一抗用抗E7的多抗兔血清）（结果见图5)。显微镜下显示，E7C获得一定表达，且在细胞内均有分布，由于去除了Rb结合区，因而，E7C产物不局限于核内分布。
图5 E7C产物在B16细胞中的表达(免疫组织化学检测)
Fig 5.E7C expression in B16 cell (detection by immunohistochemistry)
a:Negative 10×; b:Positive 10×; c:Positive 40×
4. E7C亚基因肌肉内接种激活E7特异性CTL：提纯后的pLNCE7C质粒以闭环为主，按50μg每小鼠免疫C57BL/6小鼠后，在体外以51Cr特异性释放法观察其CTL激活的情况。效应细胞与靶细胞在不同比例下其杀伤活性如图6所示，以E7免疫组与未免疫组作对照
图6 E7与E7C亚基因肌肉内接种激活特异性CTL的活性比较
Fig 6.E7-specific CTL induction by E7 or E7C inoculating into the muscle of mice
5. B7-1和E7协同诱导特异性CTL：pLNCmB7-1与pLNCE7经纯化后，以1∶1比例混合，50μg/只小鼠接种，体外测定CTL活性，结果如图7。以单独B7-1免疫组作对照。
图7 B7-1与E7C协同或E7C单独诱导E7特异性CTL的活性比较
Fig 7.E7-specific CTL induction by E7C alone or costimulating with B7-
讨论
证实E7为肿瘤排斥抗原后〔3〕，E7引起了广泛的重视。但其作为HPV16的主要转化基因〔4〕，又排除直接用作疫苗的可能；因而，利用E7的抗原性而灭活其转化活性是E7基因成为正式DNA疫苗被应用的前提。
E7的抗原表位分析表明：E7C端拥有大多数抗原表位。Stauss实验室〔5〕利用转染E7的EL4细胞，分离纯化细胞表面递呈的表位发现：49～57位氨基酸为H-2 Db位点递呈的主要CTL表位，E7免疫小鼠后分离的脾细胞可以在体外有效杀伤此9肽孵育RMA-S靶细胞，而对其它位置的肽孵育靶细胞无杀伤作用。Ressing〔6〕等利用HLA-A2来寻找与其结合的表位发现：E7的11～20位，82～90位，86～93位为主要CTL表位，由这些肽诱导产生的CTL在体外可有效溶解HLA-A2的Caski细胞系。Luxton〔7〕比较正常人与宫颈病变患者PBL对E7序列相应的合成肽的增殖反应，正常人组47％的PBL对肽刺激出现反应，其中6人只对E7 80～94位氨基酸肽产生增殖效应；在Ⅲ级宫颈不典型增生组，有5人(56％)出现针对75～94位氨基酸肽的反应。因而，利用E7C端研制核酸疫苗具有实用价值。
基于安全性考虑，本研究避开具有转化活性的pRB抑癌蛋白结合区，构建E7C端（39aa～98aa）亚基因表达质粒，在体外试验所扩增的E7C具有在真核细胞中表达的能力，其产物主要分布于细胞质中，与pRB蛋白的定位无关 (pRB蛋白位于核内)，这说明E7C失去与pRB蛋白的作用能力，因而亦无转化活性；Galloway发现〔8〕，缺失6～10位或22～26位氨基酸可致E7的转化活性完全消失。
利用无转化活性的E7C表达质粒进行裸DNA的免疫，体外分离经免疫小鼠的脾细胞，观察此脾细胞对RAHYNIVTF 9肽（相当于E7 49～57位氨基酸）孵育的RMA-S细胞的杀伤活性。图3结果显示：所诱导CTL活性与野生型E7无明显差异。这说明，E7C端亚基因较好地保留了E7的免疫原性，用于研制疫苗具有一定的价值。
随着T细胞双信号活化机制的发现，人们对共激活分子产生极大的兴趣。B7-1分子首先被应用于抗肿瘤免疫。Chen L〔9〕将B7-1与E7共转染K1735-M2黑色素瘤细胞后，瘤细胞抗原性明显增强；单独转染E7的B16瘤细胞在同系小鼠上很快成瘤，而共转染的瘤细胞不仅不能成瘤，而且排斥其后接种的B7-1－E7＋的瘤细胞。在本室以前的研究中，采用B7-1与E7以混合质粒注射的方式进行免疫。发现可以激活机体抗E7的特异性细胞免疫，并较单独E7注射效果明显加强。在本研究中，利用E7C亚基因与B7-1联合免疫，所获得的结果与以前相似，这不仅进一步证明E7C的免疫原性，同时也再一次显示联合免疫在提高抗原性方面的可行性。
本项目受自然科学基金资助 (项目号为3958004 )
参考文献
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(收稿：1997-12-18 修回：1998-03-23)