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逆转录病毒载体介导的IL-4基因修饰对HL-60细胞增殖及T细胞功能的影响
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 基础免疫学
作者：赵晓东 李成荣 杨锡强 黄贵清 王莉佳 张远维
单位：400014 重庆医科大学儿童医院免疫研究室
关键词：白细胞介素4；白血病；基因转移；基因治疗；基因表达
【 摘要 】 目的 观察IL-4基因转染对HL-60增殖及T细胞功能的影响及其可能机制。方法 采用逆转录病毒载体介导基因转染法将人IL-4基因导入髓系白血病细胞HL-60，观察高表达外源性IL-4基因HL-60株的增殖反应及其诱导的正常人PBMC增殖，IL-2、IL-6、IFN-γ基因表达及肿瘤特异性CTL杀伤活性。结果 rIL-4或瘤细胞产生的IL-4早期促进HL-60细胞增殖，培养5天后则明显抑制其增殖；与rIL-4处理的HL-60细胞比较，IL-4基因修饰的HL-60细胞明显促进正常人PBMC增殖并合成IL-2、IL-6及IFN-γ mRNA，其诱导的特异性CTL杀伤活性明显高于野生型HL-60、仅导入载体的HL-60和加入rIL-4共育的HL-60细胞诱导者。结论 IL-4基因转染在影响HL-60细胞增殖和分化过程的同时，可能促进某些抗原（如MHCⅠ类抗原）的抗原性，从而有利于机体建立有效的抗肿瘤免疫反应。
Effects of IL-4 gene transfection on proliferation of HL-60 cells and functions of T lymphocyte ZHAO Xiaodong, LI Chengrong, YANG Xiqiang, et al. Children's Hospital, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400014
【 Abstract 】 Objective To observe the effects of IL-4 gene transfection on proliferation of HL-60 cells and functions of T lymphocyte, and investigate its possible mechanism.Methods IL-4 cDNA was transfected into HL-60 cells via method of retroviral vector-mediated gene transfer. Proliferation of high IL-4-producing HL-60 and proliferation, mRNA expression of IL-2, IL-6 and IFN-γ of HL-60-stimulated T lymphocyte as well as killing activity of HL-60 specific cytotoxic T lymphocyte were determined.Results In the early phase, exogenous IL-4 or autocrine IL-4 stimulated proliferation of HL-60. But on the 5th day of culture, proliferation of HL-60 dramatically dropped down to the level which was lower than that of HL-60 parental cells. Compared with HL-60 parental cells and HL-60-neo cells, IL-4-transfected HL-60 cells were capable of enhancing proliferation of normal PBMC, stimulation mRNA expression of IL-2, IL-6, IFN-γof PBMC, and up-regulating killing activity of HL-60-specific cytotoxic T lymphocyte.Conclusion It could be deduced that IL-4 gene transfection enables HL-60 to stimulate T lymphocyte more efficiently, possibly via up-regulating expression of certain antigens, such as MHC class I antigen.
【 Subject words 】 IL-4 Leukemia Gene transfer Gene therapy
HL-60为一髓系白血病细胞株，受诱导剂作用可分化为粒细胞、单核细胞、巨噬细胞或嗜酸性粒细胞，是一种有用的研究白血病细胞增殖及分化的体外模型。Vassilidis等于1992年发现rIL-4可通过细胞表面的受体介导刺激HL-60细胞RNA合成，抑制HL-60细胞生长并诱导其分化，证实rIL-4在髓系白血病的免疫治疗领域具有潜在应用前景。我们采用逆转录病毒介导的基因转染法，将IL-4基因导入HL-60细胞，以rIL-4处理的HL-60细胞为对照，观察IL-4基因修饰对HL-60细胞增殖及T淋巴细胞功能的影响。
材料与方法
1．IL-4基因转染的HL-60细胞：由本室制备保存〔1〕。
2．HL-60细胞体外增殖反应动态观察：采用3H-TdR掺入法。调细胞浓度至5×105/ml，按3ml/孔加入6孔板。设：a.野生型HL-60组；b.载体修饰HL-60（HL-60-neo）组；c. rIL-4组（首日加入rIL-4 100U/ml，以后每日加入rIL-4 50 U/ml）；d.IL-4基因修饰的HL-60组(H-IL-41)；e.H-IL-41+IL-4单抗组(每日加入鼠抗人IL-4单克隆抗体0.5μg/ml)。
d、e 两组所用H-IL-41观察前培养细胞密度维持在105/ml以下，每日半量换液，以保持培养系统内仅存极低浓度的IL-4。培养过程中收集的上清采用ELISA法测定其IL-4水平均低于2pg/ml。以上各组置37℃、5％ CO2及95％湿度条件下培养，于培养第24、72小时及第5天取105细胞加入55孔板（重复3孔），同时加入3H-TdR继续培养6小时，收集细胞进行液闪计数。
3．HL-60细胞诱导的正常人PBMC增殖反应：以淋巴细胞分离液从正常肝素抗凝血分离外周血单个核细胞（PBMC），用丝裂霉素C（40μg/106，37℃，1小时）处理的肿瘤细胞（HL-60、HL-60-neo、H-IL-41～5）作为刺激细胞，加PBMC（105/孔）于55孔培养板，分别加入各种刺激细胞（104/孔），IL-4单抗阻断孔加入0.5μg/ml鼠抗人IL-4单抗，rIL-4对照组加入0.1μg/ml rIL-4。各组加入3H-TdR后继续培养16小时，收集细胞测定3H-TdR掺入值。
4．HL-60细胞诱导的正常人PBMC产生IL-2、IL-6及IFN-γ mRNA：加入106 PBMC（1ml）于24孔板，分别加入丝裂霉素C处理的肿瘤细胞105/孔（100μl）或rIL-4，分以下几组：a.PBMC+H-IL-41;b.PBMC+HL-60;c.PBMC+rIL-4(0.2μg/ml);d.PBMC+HL-60+rIL-4(0.2μg/ml)。混匀后置37C，5％ CO2培养，于培养后12、24小时收集细胞提取总RNA，用RT-PCR检测IL-2、IL-6和IFN-γ基因表达，同时用β-actin作为内质控。引物如下：
IL-2 sense:5＇-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3＇;
antisense:5＇-GTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC-3＇。
IFN-γ sense:5＇-ATGAAATATACAAGTTATCTTGGCTTT-3＇;
antisense:5＇-GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT-3＇。
IL-6 sense 5＇- ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3＇;
antisense 5＇- GAAGAGCCCCTCAGGCTGGACTG-3＇。
β-actin sense:5＇-ATGGATGATGATATCGCCGCG-3＇;
antisense:5＇-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC-3＇。
5． HL-60特异性CTL杀伤活性检测：参照Thomas F介绍的方法略加改良〔2〕。常规分离PBMC。丝裂霉素C处理（40μg/106，37℃，1小时）HL-60、HL-60-neo、HL-IL-41、rIL-4诱导5天的HL-60及B7基因转染的HL-60（HB7，本室黄贵清博士后提供）〔3〕刺激细胞，107 PBMC中加入刺激细胞5×105，总容积4ml，37℃，5％ CO2孵育，1周后收集反应细胞再刺激，24孔板每孔加入反应细胞2×106、刺激细胞2×105、自身PBMC饲养细胞105（丝裂霉素处理），培养48及96小时后加入IL-2（2U/ml），一周后收集效应细胞测CTL活性。51Cr标记HL-60（3700kBq/106 cells,37℃过夜），PBS洗涤后调浓度至105/ml。采用4小时51 Cr释放试验，不同效、靶比例重复3孔，37C，5％ CO2孵育4小时，1500r/min离心5分钟，收集上清，测定各管cpm值，按下式计算CTL杀伤活性，以杀伤率（％）表示。
＊＊＊＊＊＊＊＊ ％杀伤活性=(（效应细胞+靶细胞）cpm值-效应细胞空白值（cpm）)/(最大靶细胞释放值（cpm）)×100
结果
1．HL-60细胞表达IL-4水平：如表1所示，野生型HL-60和HL-60-neo细胞均不表达IL-4，而H-IL-41～5均表达不同水平IL-4。
表1 HL-60细胞表达IL-4水平（pg/106细胞,24小时）
Table 1. Levels of IL-4 produced by HL-60 (pg/106 cells,24h)
| Cell lines | IL-4 |
| Parental HL-60 | 0 |
| HL-60-neo | 0 |
| H-IL-41 | 65.4 |
| H-IL-42 | 46.8 |
| H-IL-43 | 25.1 |
| H-IL-44 | 24.3 |
| H-IL-45 | 5.9 |
2．HL-60细胞增殖反应动态观察：如表2所示，野生型HL-60及HL-60-neo细胞的体外增殖反应维持在较稳定的水平。而加入rIL-4后24小时HL-60细胞体外增殖反应水平明显升高，随后逐渐降低至野生型HL-60细胞增殖反应水平以下。H-IL-41培养24、48小时及5天时的增殖反应水平与加入rIL-4的野生型HL-60细胞类似。在H-IL-41培养系统中加入IL-4单克隆抗体可使H-IL-41增殖反应维持在较稳定的水平。证实H-IL-41培养初期增殖反应增强及培养5天后增殖反应明显降低均与其自身产生的IL-4有关。
表2 HL-60细胞增殖反应的动态观察（cpm）
Table 2. Proliferation of HL-60 cells(cpm)
| cell lines | 24h | 48h | 5th day |
| Parental HL-60 |
6 298±1 034 |
6 487±1 745 |
6 824±1 398 |
| HL-60-neo | 7 154±1 788 | 6 190±1 022 | 6 354±1 521 |
| HL-60-rIL-4 | 10 222±2 879 | 5 730± 879 | 4 820± 624 |
| H-IL-41 | 18 766±3 758 | 9 244±1 539 | 3 847± 524 |
| H-IL-42 | 15 279±3 265 |
- |
- |
| H-IL-43 | 10 386±2 568 |
- |
- |
| H-IL-44 | 9 082±2 066 |
- |
- |
| H-IL-45 | 9 123±1 091 |
- |
- |
| H-IL-41+IL-4McAb | 8 851±2 015 | 7 566±1 735 | 7 890±1 935 |
Each test was repeated at least 3 times and each cell line repeated 6 wells
3．HL-60细胞诱导的正常人PBMC增殖反应：如表3所示，rIL-4可轻度诱导正常人PBMC增殖。表达IL-4的5株HL-60细胞和用rIL-4处理的诱导的正常人PBMC增殖反应水平明显强于野生型及仅导入载体的HL-60细胞诱导者。IL-4单克隆抗体不能阻断上述增强作用。培养开始后48小时，IL-4单克隆抗体亦不能阻断。
表3 HL-60细胞诱导的正常人PBMC体外增殖反应（cpm）
Table 3. Proliferation of normal PBMC induced by HL-60 cells(cpm)
| Inducing
cells |
Control | IL-4
McAb |
rIL-4 | rIL-4+
IL-4 McAb(0h) |
rIL-4+
IL-4 McAb(48h) |
| No cells | 412 | - | 564 | - | - |
| Parental
HL-60 |
619 | - | 1 384 | 469 | 1 643 |
| HL-60-neo | 546 | - | 1 748 | 588 | 1 790 |
| H-IL-41 | 3 730 | 3 607 | - | - | - |
| H-IL-42 | 2 715 | 2 682 | - | - | - |
| H-IL-43 | 3 680 | 3 984 | - | - | - |
| H-IL-44 | 2 114 | 2 003 | - | - | - |
| H-IL-45 | 2 608 | 2 905 | - | - | - |
4． HL-60细胞诱导正常人PBMC产生细胞因子：如图1所示，野生型HL-60、单独加入rIL-4及同时加入rIL-4和野生型HL-60均未能诱导正常人PBMC表达IL-2、IFN-γ及IL-6基因。而H-IL-41诱导的正常人PBMC培养12小时及24小时均有明显的IL-2 mRNA、IFN-γ mRNA和IL-6 mRNA表达。
图1 HL-60细胞诱导的正常人PBMC产生细胞因子mRNA
Fig 1. Expression of IL-2 mRNA,IL-6 mRNA and IFN-γ mRNA of normal PBMC stimulated with HL-60 cells
1:HL-60+rIL-4, 2: rIL-4, 3: HL-60, 4:H-IL-41,24h, 5:H-IL-41,12h
5．HL-60细胞特异性CTL杀伤活性：图2为3次重复实验示意图。野生型HL-60和HL-60-neo仅能诱导轻度CTL杀伤活性，H-IL-41、加入rIL-4 共培养的HL-60诱导的CTL杀伤活性则明显增强，尤以H-IL-41诱导者为显。加入rIL-4共培养的HL-60诱导CTL 杀伤活性较H-IL-41诱导者低，提示由瘤细胞自身分泌的IL-4可能具有更高效的作用。
图2 HL-60细胞诱导的CTL杀伤活性示意图
Fig 2. Killing activity of cytotoxic T lymphocyte induced with HL-60 cells
讨论
HL-60已被较广泛地用于白血病分化机制的研究〔4〕。近年发现，IL-4可抑制HL-60细胞生长并诱导其分化为单核细胞，为IL-4基因转染HL-60细胞的研究提供了线索。
本研究发现，表达高水平IL-4的H-IL-41细胞及rIL-4处理的HL-60细胞培养5天后均表现为增殖反应受抑，但早期其增殖反应却增强，此与Vassilidis等的结果相反〔5〕。细胞增殖、分化或死亡等过程早期多表现为细胞活化、增殖反应增强及一系列基因激活并表达相应的蛋白质，导致细胞向不同方向发展。因而我们认为，自分泌IL-4或rIL-4早期更可能通过诱导HL-60增殖并表达一些抑制HL-60细胞进一步分裂，但促进其分化的蛋白质，最终诱导其向良性化方向发展。
rIL-4具有诱导HL-60细胞分化并促进一些抗原表达的作用已被证实，但HL-60细胞分化同时伴随的抗原性改变是否能更有效地诱导机体建立抗肿瘤免疫反应却不甚明了〔6〕。本研究发现H-IL-41～5诱导的PBMC增殖反应明显增强，且此效应不被IL-4单克隆抗体阻断，H-IL-41细胞或加入rIL-4共育的野生型HL-60诱导的CTL杀伤活性较HL-60和HL-60-neo诱导者明显升高，提示HL-60细胞分化过程中所伴随的抗原性改变极可能参与T细胞的激活与CTL反应的建立。由于IL-4可能通过诱导肿瘤细胞抗原性改变间接刺激PBMC增殖，故其效应不能被IL-4单抗所阻断。
已证实MHC Ⅰ类抗原在IL-4诱导的HL-60细胞分化过程中表达上升，而T细胞识别肿瘤抗原受MHC Ⅰ类抗原限制，是建立CTL 杀伤机制的重要分子，因而，推测IL-4基因转染亦可能与rIL-4具有类似作用，使HL-60细胞MHCⅠ类抗原表达增多。H-IL-41细胞诱导表达的IL-2、IFN-γ和IL-6等细胞因子可能亦参与了CTL反应的建立过程。至于属TH2类细胞因子的IL-4的基因转染为何导致IL-2、IFN-γ等TH1类细胞因子产生，我们认为可能亦与MHC I类抗原等抗原表达水平有关。因为野生型HL-60加rIL-4并不能诱导上述细胞因子产生，故可推测IL-4基因转染可能影响HL-60细胞抗原性，但其细节尚待进一步研究。
本文受国家自然科学基金资助(编号：39470744)
参考文献
1 赵晓东，李成荣，杨锡强.人IL-4逆转录病毒重组体的构建及在人肿瘤细胞中的表达.重庆医科大学学报，1998，23∶1-4.
2 Thomas FG,Renauld JC,Van pel A, et al. Costimulation of antitumor immunity by the B7,IL-6 and IL-12 is sufficient for primary generation of murine antitumor cytolytic T lymphocytes in vitro. J Immunol,1995,154∶5637-5648.
3 黄贵清， 李成荣， 杨锡强. 重组B7逆转录病毒载体的构建及表
达.重庆医科大学学报，1998，23∶137-139.
4 Collins SJ. The HL-60 promyelocytic leukemia cell line: proliferation, differentiation and cellular oncogene expression. Blood,1987,70∶1233-1244.
5 Vassilidis S,Kyrides N, Papamatheakis J. The role of IL-4 in human myeloid leukemia: Stimulation of RNA synthesis and transduction of differentiation singnalsthrough an IL-4 receptor leads to functional and HLA positive HL-60 cells. Leukemia and lymphoma, 1992,7∶235-242.
6 Musiani P,Modesti A, Giovarelli G, et al. Cytokines, tumor cell death and immunogenicity: a question of choice. Immunol Today , 1997,18∶32-36.
(收稿：1998-04-16 修回：1998-09-21)