点击显示 收起
含人突变DHFR基因的逆转录病毒对造血细胞的转导及造血功能的作用
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 肿瘤免疫
作者：张文卿 许佐良 于杰 赵实诚 徐光炜
单位：100034 北京医科大学临床肿瘤学院 北京肿瘤防治研究所 北京肿瘤医院(张文卿 许佐良 于杰 张桂国 王黎明 徐光炜)；美国Sloan-Kettering癌症研究所(赵实诚)
利用逆转录病毒介导，成功地将许多基因导入了造血干细胞，含人突变二氯叶酸还原酶(human dihydrofolate reductase,hDHFR)基因的产病毒细胞AM12-S31，能稳定产生高滴定、安全有效的非复制型逆转录病毒，并能成功转染小鼠造血细胞，表达hDHFR基因〔1〕。本研究应用该载体系统，将hDHFR基因导入小鼠骨髓细胞，通过ex vivo方式回输给经致死剂量照射的小鼠，于体内研究了其对小鼠造血功能的作用。
材料与方法
1.载体：DC/SV-hDHFRS31质粒由美国Sloan-Kettering癌症研究所赵实诚教授惠赠。系衍生于Moloney小鼠白血病病毒的双拷贝逆转录病毒载体，克隆了655bp人31位突变(Phe→Ser)的DHFR cDNA片段〔2〕。
2.动物及细胞株：C57BL/6J小鼠，雄性，8～11周龄。购自北京医科大学动物部。随机分为实验组和对照组，每组8～10只动物。由北京医科大学放射医学研究所钴源室照射。
WEIHI-3b细胞、兼性包装细胞EP-EAM12(简称AM12)和产病毒细胞AM12-S31由本室冻存。后者是将DC/SV-hDHFRS31载体导入包装细胞AM12，经G418筛选生成的阳性克隆细胞培养而成。上述细胞生长于含20% FCS、1% L-谷氨酰胺和1%青、链霉素的高糖DMEM培养基中。
3.小鼠骨髓细胞的分离和转染：雄性8～11周龄C57BL/6J小鼠3～5只，尾静脉注射5-FU(150mg/kg),3天后常规收集股骨和胫骨骨髓的有核细胞。以含20% FCS和10% WEIHI-3b培养上清的IMDM培养1天。转染前2小时以15Gy(1Gy=100rad)照射产病毒细胞和AM12细胞，然后与骨髓细胞以1∶1细胞数比共培养于含8μg/ml polybrene、1ng/ml mSCF和100ng/ml mIL-6上述IMDM中，转染48小时。
4.骨髓移植和体内筛选：收集转导后的骨髓细胞，尾静脉注入经(8.5～9.0)Gy照射的同系小鼠(2×106细胞/鼠)。2天后腹腔注射甲氨喋呤(methotrexate,MTX)筛选，第一周剂量为4mg/kg,每周2次;以后各周10mg/kg，每周2次。观察白细胞、红细胞压积、体重和总的生存率等指标。
5.小鼠组织基因组DNA的提取〔3〕：脾、肝、肾组织适量，加入2ml DNA裂解液以匀浆机匀浆，加20μl 10mg/ml RNase A;40μl 20mg/ml蛋白激酶K，37℃反应12～16小时，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，冰浴10分钟；离心后上清加0.5体积7.5mol/L乙酸铵、2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，3000r/min 4℃离心2分钟，75%乙醇洗涤2次，真空干燥沉淀 ，TE缓冲液溶解沉淀，定量、分装，4℃储存。
6.PCR分析及其产物的Southern印迹杂交〔4〕：利用PCR分析小鼠组织DNA中标志基因Neor的整合情况。50μl体系含5～10μl染色体DNA，1.25mmol/L dNTP,1×PCR buffer,1.5mmol/L MgCl2，两种引物各1μl(300ng/ml)。0.7μl Taq DNA polymerase。引物序列为：5＇GGA AGC CGG TCT TGT CGA TC-3＇及5＇-CGA AAT CTC GTG ATG GCA GG-3＇。利用自动PCR仪扩增。第一循环为94℃变性3分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟；35～40循环之后为94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟。取5μl产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳。按文献〔3〕进行转膜及烤膜，以地高辛标记的Neor基因探针进行Southern印迹杂交、免疫沉淀、照像。
结果与讨论
1.骨髓移植和体内筛选下小鼠血象、体重及生存情况：以不同剂量照射小鼠，在不同的移植和选择条件下，观察小鼠造血功能重建情况，8.0Gy照射剂量为亚致死剂量(8.5～9.0)Gy照射剂量为合适的致死剂量。将转导后的骨髓细胞回输给经致死剂量照射的小鼠后，用MTX筛选。结果第14天致死剂量照射的对照组和实验组小鼠白细胞、红细胞和红细胞压积明显下降，随后实验组血象逐渐恢复，第28天红细胞和红细胞压积恢复正常，白细胞明显回升。致死剂量照射的对照组小鼠于21天内全部死于严重贫血、胃肠道出血和极度消瘦。亚致死剂量照射的对照组血象变化类似于实验组，但第14天其白细胞计数、红细胞计数和红细胞压积均明显高于致死剂量照射组，说明8.0Gy剂量不能完全破坏小鼠造血功能。致死剂量照射的实验组和亚致死剂量照射的对照组生存率(第21天分别为100%和87.5%)明显高于致死剂量照射的对照组(第21天，0%)，生存期亦较后者延长(图1)。实验组和对照组小鼠体重第14天明显下降，以后对照组继续下降，而实验组小鼠体重逐渐回升。说明小鼠移植转导了hDHFR基因的骨髓后，在MTX选择压力下，能够重建致死剂量照射后小鼠的造血功能并保护其免遭MTX的细胞毒作用。
图1 骨髓移植和MTX筛选后小鼠的生存率
AM12-1:8.5Gy照射小鼠；AM12-2:8.0Gy照射小鼠；AM12-S31：9.0Gy照射小鼠
2.含突变hDHFR基因的前病毒DNA在小鼠基因组中的整合：为了解目的基因在体内的整合情况，以小鼠肝、脾、肾和骨髓细胞的DNA为模板，利用Neo 1和Neo 2引物行PCR分析，扩增前病毒DNA中的Neor基因。结果所有实验组脾脏、骨髓细胞和部分肝脏、肾脏组织均出现了415bp的条带。内脏组织PCR产物非特异性带较多，为确定特异性条带，我们用Neor基因探针进行了Southrn印迹分析，所有实验组脾脏、部分肝脏和肾脏均有特异阳性带。非特异性带没有显色(图2)。对照组没有阳性带。脾脏阳性信号系转导后的造血干/祖细胞着床脾脏并增殖分化成脾集落所致；肝、肾脏的阳性信号可能是其混有外周血有核细胞所致，亦不排除有髓外造血(尤其是肝脏)因素存在，有待进一步研究证实。
图2 BMT和MTX筛选后小鼠组织Neor基因PCR产物的Southern印迹分析
1.DNA marker(λDNA +EcoRⅠ/HindⅢ)；2.阳性对照(DC/SV-hDHFRS31 plasmid)；3.阴性对照；4.实验组-1 肝；5.实验组-1 脾；6.实验组-1 肾；7.实验组-2 肝；8.实验组-2 肾；9.实验组-2 肾；a.实验组-3 脾；b.实验组-3 肝；c.空白；d.实验组-4 肝；e.实验组-4 脾；f.实验组-4 肾
DHFR是细胞内叶酸代谢和细胞合成DNA 、RNA及蛋白质的关键酶。快速增殖细胞，抑制DHFR活性会导致四氢叶酸耗竭、DNA合成下降乃至细胞死亡。MTX是一种叶酸类似物，能与DHFR的活性位点紧密结合使其失活，常用于治疗乳腺癌、急性白血病、胃癌等肿瘤。但因肿瘤细胞很快会对其产生耐药；且其骨髓抑制和胃肠道粘膜的损伤作用亦较严重，限制了临床应用。
MTX耐受的主要机制之一是DHFR基因的突变。该基因的许多突变形式均能改变其对MTX的亲和力和耐受性。用逆转录病毒载体介导将突变的DHFR基因导入敏感细胞，能使之获得耐MTX表型。以产病毒的AM12-S31细胞上清与小鼠骨髓有核细胞共培养后，能有效地将hDHFR基因导入小鼠骨髓细胞，使其获得耐药表型〔1〕。本实验将转导后的骨髓有核细胞通过ex vivo方式回输给经致死剂量照射小鼠后，在高剂量MTX筛选下，进一步证实了hDHFR基因能保护骨髓免遭MTX的抑制，重建小鼠造血功能。
参考文献
1 张文卿，许佐良，于杰，等.人突变DHFR基因高效逆转录病毒载体及其在小鼠造血细胞的表达.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4∶85-89.
2 LI MX,Banerjee D,Zhao SC,et al.Development of a retroviral construct containing a human mutated dihydrofolate reductase cDNA for hematopoietic stem cell transduction.Blood,1994,83∶3403-3408.
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A laboratory manual.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory press,1989.
4 Mullis KB and Faloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction.Methods Enzymol,1987,155∶335-351.
(收稿：1998-05-20 修回：1998-10-12)