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成年大鼠星形细胞经LPS、前炎症因子和免疫调节因子刺激后β-趋化因子的分泌
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 细胞因子
作者：国红 金宇宣 许贤豪 石川翰男 肖保国 黄煜敏 Hans Link
单位：100730 卫生部北京医院神经科(国红 许贤豪)；上海医科大学华山医院神经科(金宇宣)；瑞典卡洛林斯卡医学院呼町医院神经科(石川翰男 肖保国 黄煜敏 Hans Link)
关键词：星形细胞；趋化因子；细胞因子
【 摘要 】 目的 研究在中枢神经系统(CNS)的炎症性疾病中，作为构成血脑屏障结构的组成部分之一，可引起白细胞浸润的星形细胞分泌趋化因子的影响因素。方法 通过星形细胞体外培养，经不同细胞因子刺激，用原位杂交检测成年大鼠星形细胞β-家系趋化因子的mRNA表达。结果 IFN-γ可引起MCP-1，RANTES，MIP-1α和MIP-1β的mRNA表达；TNF-α可引起RANTES和MIP-1β的mRNA表达；LPS可引起MIP-1α和MIP-1β的mRNA表达。TGF-β和IL-10下调由LPS引起的MCP-1和MIP-1α和MIP-1β mRNA表达。TGF-β和IL-10可抑制由TNF-α引起的MCP-1和RANTES的mRNA表达。IL-10还可下调由TNF-α引起的MIP-1β mRNA表达。结论 成年大鼠体外试验中的星形细胞可由LPS和前炎症因子刺激，产生β-家系趋化因子mRNA的表达。而调节因子如TGF-β和IL-10可抑制由IFN-γ、TNF-α和LPS引起的β-家系趋化因子的mRNA表达。
Secretion of β-chemokine from the adult rat astrocytes stimulated by LPS, proinflammatory cytokines and immunoregulatory cytokines GUO Hong*, JIN Yuxuan, XU Xianhao, et al. * Department of Neurology, Beijing Hospital, Ministry of Health, Beijing 100730
【 Abstract 】 Objective To investigate factor(s) regulating astrocyte chemokine expression, we examined the induction of β-chemokine mRNA expression in adult rat astrocytes.Methods By in situ hybridization, we determined the β-family chemokine mRNA expression in the astrocytes which were cultivated in vitro and stimulated with different agents.Results Astrocyte-derived MCP-1, RANTES, MIP-1α and MIP-1β mRNA were easily induced by IFN-γ. TNF-α induced RANTES and MIP-1β mRNA expression, and LPS induced MIP-1α and MIP-1β mRNA expression in astrocytes. LPS-induced MCP-1 and RANTES mRNA expression by astrocytes were antagonized by TGF-β and IL-10. TGF-β and IL-10 also down-regulated MCP-1 mRNA expression induced by TNF-α, and IL-10, but not TGF-β, inhibited MIP-1β mRNA expression induced by TNF-α.Conclusions The results of this in vitro study suggest that β-chemokine mRNA expression by adult rat astrocytes can be induced by LPS or proinflammatory cytokines, while regulatory cytokines, such as TGF-β and IL-10, down-regulate the induction of astrocyte-derived β-family chemokine mRNA expression induced by LPS, IFN-γ and TNF-α.
【 Subject words 】 Astrocyte Chemokine Cytokine
在中枢神经系统(CNS)内部，只有极少量的T细胞存在，在脑损伤、脓肿和多发性硬化(MS)及其动物模型(急性变态反应性脑脊髓炎，EAE)等疾病中，炎症细胞被吸引进入CNS，是病理和防御过程产生和发展的关键。
星形细胞是组成血脑屏障(BBB)的胶质细胞，在CNS内起着多种作用。以往资料显示，在CNS的自身免疫性疾病、炎症性疾病和急性损伤中，BBB内星形细胞分泌的趋化因子参与了对外周血单核细胞和T淋巴细胞的吸引过程〔1-3〕。
体外试验还发现LPS，TNF-α，IFN-γ,IL-1β可引起星形细胞分泌趋化因子〔4，5〕。但大部分研究集中于人胚胎和新生鼠的星形细胞，较少关于成年大鼠星形细胞趋化因子分泌和调节情况的报道。
我们观察了成年大鼠星形细胞经LPS，前炎症因子(TNF-α和IFN-γ)和免疫调节因子(TGF-β和IL-10)作用后趋化因子的mRNA表达情况。主要包括：1.单核细胞化学趋化蛋白质(MCP-1)；2.RANTES(regulated upon activation,normal T cells,expressed and secreted)。3.巨噬细胞感染蛋白质-1α(MIP-1α)；4.巨噬细胞感染蛋白质-1β(MIP-1β)。
材料与方法
1.材料：大鼠重组IFN-γ，大鼠重组TNF-α由P.vander Meide博士惠赠(TNO Primate Center,Rijswijk,the Netherlands)。人重组IL-10(人重组IL-10对大鼠、小鼠和人的靶细胞均有活性，和大鼠IL-10有80%的同源性)由Schering Plough Research Institute，Kenjilworth NJ惠赠。人重组TGF-β(和大鼠重组TGF-β有90%的同源性)由美国Genetech,Inc.San Francisco,CA惠赠。LPS从Sigma公司购买。
2.星形细胞培养：取6～8周Lewis大鼠脑，机械研碎，用Dulbeeco修改的Eagle液(Gibco,Paisleg,UK),〔加入2mmol/L谷酰胺(Flow,Irvine,UK),10%灭活的胎牛血清(Gibco),50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco,Paisley,UK),体积数分别为1%的MEM氨基酸(Gibco)和10mmol/L Hepes(Sigma)〕洗涤，并制成106/ml的细胞悬液放入75cm2的培养盒中培养(37℃，5%CO2)。2～3小时后，破碎的髓鞘成分和未附壁的细胞经过100r/min,1～2分钟摇动去除后再培养2周(每周更换一次培养液)，在75cm2培养盒中的单层星形细胞最后摇动100r/min,24小时用以去除寡树突细胞。
3.用LPS和细胞因子刺激：将星形细胞制成1.5×104/ml浓度的悬液，放在24孔培养板中(Costar,Canbridge,MA)分别加入LPS(10μg/ml)，IFN-γ(10U/ml),TNF-α(100U/ml),IL-10(100ng/ml),TGF-β(100ng/ml)以及PBS于37℃，5%CO2培养24小时后，收集细胞，并用DEPC处理过的PBS洗涤3次，之后制成105/ml浓度的细胞悬液，点10μl于载玻片上(probe on slides, Fisher Scientific,Pittsburgh,PA),细胞在55℃烤干10分钟后密封于盒中保存在-20℃待用。
4.用原位杂交方法检测趋化因子的mRNA表达：MCP-1，RANTES，MIP-1α和MIP-1β的寡核苷酸探针购自R&D(R&D Systems Europe,Abingdon,UK),用35S(Dupont Scandinavia,Stockholm, Sweden)标记探针，细胞于42℃用杂交液杂交18小时，在放射自显影后，显影、定影，最后晾干，在放大20倍显微镜(暗视野)下计数阳性细胞(每个细胞包含超过15个亮点的细胞定为阳性细胞)。以上资料为双盲获得。
5.统计学分析：资料用平均数±标准差显示，各组间相互比较用双尾学生t检验，3组与同一组比较用单尾学生t检验，统计学意义用*表示：*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。
结 果
未被刺激的成年大鼠星形细胞在体外培养2周后发现其表达MCP-1，RANTES，MIP-1α，MIP-1β的mRNA量非常低(图1A，B，C和D)。
图1 成年大鼠星形细胞经IFN-γ、TNF-α和LPS刺激表达β-趋化因子mRNA的情况
Fig 1. The β-chemokine mRNA expression of adult rat astrocytes stimulated by IFN-γ、TNF-α and LPS
IFN-γ单独可以引起MCP-1的mRNA表达，但单用TNF-α和LPS则不然。IFN-γ+LPS，IFN-γ+TNF-α以及TNF-α+LPS均可上调星形细胞表达MCP-1 mRNA。TNF-α与LPS或IFN-γ结合引起高水平MCP-1的mRNA表达(图1A)。
除LPS外，单用IFN-γ和TNF-α均可引起RANTES的mRNA表达。LPS与IFN-γ或TNF-α结合都可以增加RANTES的mRNA表达；IFN-γ单独应用可以引起很强RANTES的mRNA表达，但与TNF-α结合却引起相反的结果(图1B)。
LPS，IFN-γ以及它们相互或分别与TNF-α结合都可以引起MIP-1α及MIP-1β的mRNA表达；TNF-α单独应用不能引起MIP-1α mRNA表达，但可以引起MIP-1β mRNA表达(图1C、D)。
TGF-β和IL-10可以下调星形细胞由LPS和TNF-α引起MCP-1表达mRNA(图2A，图3A)，抑制由TNF-α引起的RANTES的mRNA表达(图3B)，TGF-β可抑制由LPS引起的MIP-1α和MIP-1β的mRNA表达(图2B、C)，IL-10还能抑制TNF-α引起的MIP-1β的mRNA表达(图3C)。
图2 TGF-β和IL-10抑制由LPS引起成年大鼠星形细胞表达β-趋化因子mRNA的情况
Fig 2. TGF-β and IL-10 inhibited the β-chemokine mRNA expression of adult rat astrocytes stimulated by LPS
图3 TGF-β和IL-10抑制由TNF-α引起成年大鼠星形细胞表达β-趋化因子mRNA的情况
Fig 3. TGF-β and IL-10 inhibited the β-chemokine mRNA expression of adult rat astrocytes stimulated by TNF-α
讨 论
以往研究发现，在MS或EAE和病灶处有具有活性的CD4+T细胞和巨噬细胞的浸润，炎症细胞被吸引进入CNS是机体发生病理变化和开始防御反应的关键步骤。趋化因子是引起炎症细胞聚积的主要因素，CNS分泌的MCP-1与炎症密切相关，在无白细胞浸润部位从来未检测到趋化因子。因为星形细胞在CNS中具有特殊的功能——使CNS与循环系统分离开，所以推测星形细胞分泌的趋化因子构成了一个重要的、对某些特殊类型的细胞有化学趋化作用的信号。
星形细胞趋化因子的分泌、表达受细胞因子网络调节。TNF-α可引起人胚胎星形细胞分泌MCP-1〔4〕，预先给予IFN-γ可显著增加由TNF-α引起的新生大鼠星形细胞的MCP-1表达〔7〕。星形细胞瘤细胞和星形细胞一样可以由TNF-α或IL-1β刺激分泌RANTES〔8〕。Peteraon〔5〕还报道，IL-1β和TNF-α可引起人胚胎星形细胞分泌MIP-1α。
我们的研究结果发现，在趋化因子的表达上，成年大鼠星形细胞与以前报道的人胚胎和新生鼠的星形细胞相类似，尽管与人胚胎星形细胞相比，TNF-α单独不能引起成年大鼠星形细胞表达MCP-1的mRNA〔4〕，这个不同可能是种系和发育阶段的不同所造成。本文结果提示，早期炎症因子如：TNF-α可引起BBB内趋化因子的mRNA表达。以前的研究发现，TGF-β显著抑制星形细胞的增殖，TGF-β和IL-10可以抑制鼠星形细胞表达TNF-α，最近还证实，TGF-β和IL-10在体外培养中降低LPS的敏感性〔9〕。用TGF-β2在体外处理星形细胞可降低由IL-1β，IFN-γ和TNF-α引起的白细胞移行，TGF-β2也能抑制淋巴细胞移行进入CNS，且与剂量呈正相关。TGF-β和IL-10在体外培养中能抑制星形细胞β-趋化因子的mRNA表达，可能部分解释了为什么在EAE给予TGF-β或IL-10能抑制T细胞和巨噬细胞的浸润，TGF-β和IL-10在CNS炎症性疾病中的抑制因子的作用可能是通过抑制趋化因子的分泌来实现的。成年大鼠星形细胞很容易被LPS和前炎症细胞因子刺激表达β-趋化因子，且这种表达可以被内源的TGF-β和IL-10所抑制，这可能为免疫介导的脱髓鞘病如：MS和EAE的治疗和预防复发提供了依据。
志谢：感谢金亚平女士在统计学处理上提供的帮助。
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(收稿：1998-03-10 修回：1998-06-24)