丙型肝炎病毒非结构基因5b变异与干扰素治疗的相互影响

丙型肝炎病毒非结构基因5b变异与干扰素治疗的相互影响

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 病毒学

作者：魏来　陶其敏　孙焱　王豪

单位：100044 北京医科大学肝病研究所

关键词：丙型肝炎病毒；基因；病毒；序列分析；干扰素

　　【 摘要 】　目的　研究HCV基因组的变异与干扰素治疗应答的关系以及干扰素治疗后患者体内病毒株的改变和变异。方法　8例慢性丙型肝炎患者给予干扰素治疗，于治疗前及治疗后采集患者血清，扩增其血清中HCV非结构基因5b（NS5b）区cDNA，克隆后，每例患者挑取6个克隆，测定重组子中NS5b cDNA序列。结果　4例患者在治疗后血清中HCV阴性，为干扰素反应组，另4例于治疗中、治疗后血清中HCV RNA持续阳性，为非反应组。治疗前，反应组4例患者血清中分别含有1、1、1及3株HCV，而非反应组4例患者血清中分别含有4、5、6及6株HCV。与HC-C2或HC-J6相比，患者血清中HCV的误义突变与无义突变之比在反应组为(17.61～30.95)%间，在非反应组为(33.11～76.47)%。治疗后，非反应组4例患者中，分别有2、3、4及4株HCV被清除，各有2株HCV存留于血清中。平均氨基酸变异数在消失病毒株与存留的病毒株中分别为4.3～5.5与5.5～9.0。有2株存留的病毒株在治疗后发生了突变，1株于2 724位由甘氨酸突变为精氨酸，2 742位由缬氨酸突变为丙氨酸。结论　HCV在准种及核苷酸水平上的变异均影响干扰素治疗的效果。干扰素治疗中，HCV的清除与变异可能是同时存在的。

　　Interaction between variability of nonstructural gene5b of hepatitis C virus and interferon therapy　WEI Lai , TAO Qimin, SUN Yan, et al.Institute of Hepatology, People's Hospital,Beijing Medical University, Beijing 100044

　　【 Abstract 】　Objective　To investigate the relation between variability of hepatitis C virus (HCV) isolates and interferon therapy response, and analyze the change and mutation of HCV isolates after interferon therapy.Methods　　Eight patients with chronic hepatitis C were treated with interferon. Nonstructural gene 5b of HCV was amplified and cloned. Six HCV clones from each patient were sequenced before and after treatment. The patients were classified into two groups according to response or nonresponse to IFN.Results　Before treatment , one to three isolates were found respectively from 4 responders, on the other hand, four , five, six, and six isolates respectively in 4 nonresponsers. By comparison with HC-C2 or HC-J6, the ratio of nonsynonymous to synonymous substitution ranges from 17.61% to 30.95% in responder group, but 33.11% to 76.47% in nonresponser group. The sequence of pre- and post-treatment were composed. And the comparison showed that average numbers of varying amino acid ranged from 5.5 to 9.0 among remaining isolates, and 4.3 to 5.5 among disappeared isolates. Moreover, two changed amino acids(G-R and V-I) were found in post-treatment clones of patient B010 compared with it's pretreatment clones, and one (V-A) in patient B024.Conclusions　NS5b quasispecies as well as genetic heterogeneity correlate with IFN effectiveness. The heterogeneity of HCV in different hierarchical strata has common impact on IFN treatment in the same individuals. HCV elimination and mutation may occur alternatively during IFN therapy.

　　【Subject words】　Hepatitis C virus　　Gene,viral　　Sequence analysis 　　Interferon

　　丙型肝炎病毒（HCV）基因结构的差异可能影响着干扰素治疗效果。已有研究表明，HCV基因型状况是决定干扰素治疗效果的重要因素之一，发现 Ⅱ/1b型HCV感染者的干扰素治疗效果显著低于Ⅲ/2a型感染者^〔1-4〕。国外关于更细致的HCV基因组变异与干扰素治疗之间关系的研究也正在进行中，关于在治疗中干扰素对HCV变异的影响则鲜见报道。本组实验选择8例慢性HCV感染者。观察HCV非结构区基因5b（NS5b）在感染者体内的变化情况对干扰素治疗应答的影响，并观察在干扰素治疗过程中，非反应者体内HCV的变化情况，旨在探讨HCV变异与干扰素治疗之间的关系。

　　材料与方法

　　1. 病人及其一般情况：随机选择北京医科大学人民医院肝炎病房中8例接受干扰素治疗的慢性丙型肝炎患者，诊断符合1995年5月修定的诊断标准（第五次全国传染病与寄生虫病学术会议）。患者基本情况见表1。治疗方案为：应用α-2b干扰素，300 万单位，每日1次，1个月后改隔日1次，半年1个疗程，条件允许者可继续用。在干扰素治疗过程中，每两周采血1次，以5＇UTR引物检测患者血清中HCV RNA以判断干扰素对清除病毒的作用，若治疗中或治疗结束时，血清中HCV RNA检测连续为阴性则认为治疗有效，为治疗反应者；否则，为干扰素治疗无反应者，治疗无效。

表1　8例丙型肝炎患者干扰素治疗的一般情况

　　Table 1. Clinical characteristic of patients

No of patients	Sex/Age	Genotype	Pretreatment ALT levels	Total IFN dose(MU)
Nonresponse group
B009	F/26	Ⅱ/1b	220U/L	405
B010	F/60	Ⅲ/2a	312U/L	273
B024	M/31	Ⅱ/1b	178U/L	270
B080	M/46	Ⅱ/1b	162U/L	450
Response group
B013	M/26	Ⅱ/1b	290U/L	360
B018	M/42	Ⅱ/1b	287U/L	225
B025	M/42	Ⅱ/1b	186U/L	270
B122	M/24	Ⅱ/1b	234U/L	270

　　2. HCV NS5b区的逆转录套式聚合酶链反应扩增、分子克隆及序列分析：分别在患者开始接受干扰素治疗的前1日及1年后采血，收集血清，-70℃冻存。作NS5b区的聚合酶链反应（PCR）扩增，所用两对引物参照HCV-J与HC-C2的序列设计。引物序列与所扩增片段的位置见表2。以异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取病毒RNA。引物52#为逆转录引物，42℃逆转录反应1小时，然后以套式PCR方法扩增HCV基因NS5b区cDNA。扩增产物以EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物纯化后与pUC18载体连接，转化DH5α，提取阳性克隆的质粒以M13通用测序引物从双向测定重组子序列。其中，对每一例患者在干扰素治疗前血清HCV NS5b扩增产物阳性重组克隆，均随机挑取6个克隆，对4例干扰素治疗无效者在距治疗起始1年时血清扩增产物阳性克隆，各挑取6个克隆，序列分析后比较其序列。

表2　逆转录及聚合酶链反应引物

　　Table 2. Sequence of primers used in this study

Primer	Site of HCV-1	Sequence (5＇-3＇)
51	7 864～7 883	GAGTTCCTGGTGAATACCTG
52	8 335～8 354	GATGTTATCAGCTCCAGGTC
53	7 918～7 933	GCTGAATTCGACACCCCGCTGTTTTG
54	8 277～8 293	CAGAAGCTTTAGTCATAGCCTCCGTG

Underlines are recognition sequences of endonuclease EcoR I and HandⅢ

　　结　果

　　1．治疗反应者与无反应者的一般情况比较：由表1可知，干扰素治疗反应组与无反应组在年龄、诊断、干扰素治疗剂量等方面无显著差异。所有患者既往均未接受过其它抗病毒治疗。干扰素反应组在干扰素治疗结束后血清丙氨酸转氨酶（ALT）降至正常，而干扰素无反应者干扰素治疗结束后ALT仍有波动。

　　2．干扰素治疗前患者血清中NS5b变异对干扰素治疗效果的影响：8例患者在干扰素治疗前血清中共获得48个克隆。表3将Ⅱ/1b型与HC-C2，Ⅲ/2a型与HC-J6进行比较，比较干扰素治疗前两组每例患者6个克隆中的毒株数、核苷酸变异位点数（如同一患者不同毒株同一位点变异，仅记为一位点）及核苷酸变异所引起的异义突变数占总核苷酸变异数的比率。发现，在反应组中，有1例患者(B013),从6个克隆中分离出3株毒株，其在26个位点发生变异，致3株中共有42个密码子发生变异，其中13个密码子的变异为异义突变，占30.95%。另外3例患者从6个克隆中均只分出1株毒株，核苷酸变异位点数为144～176，所引起的异义突变数占核苷酸总变异数的比率为(17.61～29.17)%。而在非反应组，治疗前从6个克隆中分别分出5、6、6和4株毒株，分别共有41、162、55及51个位点的核苷酸发生变异，所引起的密码子中异义突变占总变异数（异义突变+同义突变）的比率分别为76.47%、33.11%、62.00%和70.59%。

表3　干扰素治疗前HCV NS5b的序列变异

　　Table 3. Sequences complexity of NS5b before IFN treatment

No. of patients	Numbers of 　　isolates from 　　six clones	Numbers of 　　nucleotide 　　variation	Nonsynonymous/ 　　synonymous 　　substitution(%)
Responder group
B013	3	26	13/42 (30.95)
B018	1	144	42/144 (29.17)
B025	1	166	30/166 (20.83)
B122	1	176	31/176 (17.61)
Nonresponder group
B009	5	41	26/34 (76.47)
B010*	6	162	47/142 (33.11)
B024	6	55	31/50 (62.00)
B080	4	51	36/51 (70.59)

*B010 was compared with HC-J6, others, HC-C2

　　3．干扰素治疗前后NS5b区变异的比较：比较了4例干扰素治疗无反应者干扰素治疗前后所测定的病毒分离物数（见表4），表中示非反应组各患者6个克隆在干扰素治疗中的变化情况。分别有2、4、4和3株毒株在治疗中消失，其平均氨基酸变异数为4.3、5.5、4.5和4.3。每例患者均有2株毒株在干扰素治疗后仍存活，其平均氨基酸变异数分别为6.3、9.0、5.5和6.7。比较在治疗中被干扰素清除以及在治疗后仍存在的病毒株NS5b区氨基酸序列，发现变异较大的HCV株在干扰素治疗后存留下来。在2例患者（B009与B024）血清中发现干扰素治疗后存留下来的变异株，1份分离物发生于氨基酸2 724位，由甘氨酸变为精氨酸及2 742位由缬氨酸突变为异亮氨酸；另1份发生于氨基酸2 758位，由缬氨酸突变为丙氨酸。

表4　干扰素治疗无反应者干扰素治疗前后NS5b区的变异

　　Table 4. Variation of NS5b protein between before and after IFN treatment

No.of 　　patient	Disappeared during treatment			Remaining after treatment
	Numbers of 　　isolates	Average 　　numbers of 　　varying aa	Numbers of 　　isolates		Average 　　numbers of 　　varying aa
B009	3	4.3	2		6.3
B010*	4	4.5	2		9.0
B024	4	4.5	2		5.5
B080	2	4.3	2		6.7

*B010 was compared with HC-J6, others, HC-C2

　　讨　论

　　多数研究中发现，基因型是仅次于患者体内病毒量决定干扰素治疗效果的第2位因素。文献指出，HCV的Ⅱ/1b型感染者对干扰素的反应显著低于Ⅲ/2a型与Ⅳ/2b型感染者，也低于Ⅰ/1a型感染者^〔1-4〕。本组实验所选择的8例慢性丙型肝炎患者中7例为Ⅱ/1b型感染者，1例为Ⅲ/2a型感染者。治疗结果显示4例Ⅱ/1b型患者治疗有效，而3例Ⅱ/1b型感染者与1例Ⅲ/2a型感染者治疗无效。

　　HCV基因组的变异对干扰素治疗效果的影响还表现在，当感染者体内存在多株HCV时，常常导致干扰素不能将所有病毒株都清除，即HCV准种的存在影响了干扰素的作用^〔5，6〕。与以上结果相仿，本组实验发现对干扰素治疗反应者体内仅含1～3株HCV,而且多为1株， 而干扰素治疗无反应者在治疗前体内有4～6株HCV 的存在。这一结果表明，不同的HCV病毒株对干扰素的敏感性可能是不同的，甚至有可能象HBV那样，在某些病毒株中存在特定的抗干扰素序列。因此，当干扰素治疗将敏感的病毒株清除时，另一些不敏感甚至抗性的病毒株可能存留下来， 在干扰素治疗结束后重又复制。

　　在临床意义上，从准种特性对干扰素治疗效果的影响中可以看出，在以往各项预测干扰素治疗效果的指标如病毒量、基因型外，患者体内存在的病毒株数可能是另一个新的预测指标。在病毒学意义上，积累更多的干扰素治疗前后的序列资料，可寻找出干扰素敏感株与干扰素抗性株之间的区别及各自的特征。

　　HCV变异与干扰素治疗相关性的另一个层次便是核苷酸与氨基酸序列变异与临床的关系。关于HCV NS5b区变异与干扰素治疗的关系鲜见报道。本组实验结果表明，干扰素治疗无反应者不仅体内有较多株的HCV,且每一株HCV在NS5b区的误义突变也显著高于干扰素反应者。即在NS5b区的误义突变也对干扰素治疗有负性影响。因为NS5b区具有HLA限制的杀伤性淋巴细胞识别位点^〔7〕，目前已有研究表明，HCV准种的变异与杀伤性淋巴细胞识别位点的变异可使HCV逃避宿主杀伤性淋巴细胞的攻击。结合既往对干扰素治疗中体液免疫攻击位点-包膜区基因变异的研究结果，认为HCV的准种变化可能与体液免疫及细胞免疫都是相关的，是体液免疫和细胞免疫共同选择压力作用下的结果。因为干扰素的治疗不可能完全脱离机体的免疫机制而发挥作用，所以，T、B细胞位点变化一样影响了干扰素的治疗效果。

　　比较干扰素治疗无反应者治疗前后氨基酸的序列可发现，那些变异较大的HCV株在干扰素治疗后存留下来。此外在B009与B024中还发现在干扰素治疗后存留下来的部分病毒株发生了变异。提示在干扰素治疗中病毒的清除与突变可能是交替出现的。

　　从本组实验结果中可以看出，干扰素治疗效果与HCV基因型的关系尚有许多有待深入研究的地方。而病人体内多株病毒的共存将是影响干扰素治疗效果的另一个因素。HCV基因组较多的误义突变有可能使HCV株突变成新的株而逃避免疫攻击，从而在干扰素治疗中存留下来。

　　参考文献

　　1　Weiner AJ, Thaler MM, Crawford K, et al. A unique,predominant hepatitis C virus variant found in an infant born to a mother with multiple variants. J Virol,1993,67∶4365-4368.

　　2　Martell M, Esteban JI, Quer J, et al. Dynamic behavior of hepatitis C virus quasispecies in patients undergoing orthotopic liver transplantation. J Virol,1994,68∶3425-3436.

　　3　Kato N, Sekiya H, Ootsuyama Y, et al. Humoral immune response to hypervariable region 1 of the putative envelope glycoprotein(gp70) of hepatitis C virus. J Virol,1993,67∶3923-3930.

　　4　Nozaki C, Nishihara T, Makizumi K, et al. Expression and epitope analysis of hepatitis C virus NS1. Int Hepatol Commun,1993,1∶31-36.

　　5　Weiner A, Erickson AL, Kansopon J, et al. Persistent hepatitis C virus infection achimpanzee in association with emergence of a cytotoxic T lymphocyte escape variant. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92∶2755-2759.

　　6　Kanazawa Y, Hayash N, Mita E, et al. Influence of viral quasispecies on effectiveness of interferon therapy in chronic hepatitis C patients. Hepatology, 1994,20∶1121-1130.

　　7　Battegay M, Fikes J, Di Bisceglie AM, et al. Patients with chronic hepatitis C have circulating cytotoxic T cells which recognize hepatitis C virus-encoded peptides binding to HLA-A2.1 molecular. J Virol, 1995,69∶2462-2470.

(收稿：1998-02-12　　修回：1999-04-07)