点击显示 收起
幽门螺杆菌cagA基因探针的制备与临床应用
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第3期第19卷 免疫检测
作者：徐义辉 糜克永 龙焱华
单位：徐义辉 糜克永 430071 武汉 中国科学院武汉病毒研究所；龙焱华 武汉市第三人民医院
关键词：幽门螺杆菌；cagA基因；克隆；长臂光敏生物素
【 摘要 】 目的 研究cagA+Hp(幽门螺杆菌)与胃肠道疾病的关系，并探讨长臂光敏生物素标记的cagA基因探针的临床意义。方法 构建含cagA基因片段的重组质粒克隆株，以重组质粒DNA为模板PCR扩增cagA基因片段用长臂光敏生物素标记产物DNA，对病人进行基因探针检测及PCR、尿酶试纸检测。结果 浅表性胃炎、深度胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性萎缩性胃炎及胃癌病人的检测结果是：尿酶检测阳性百分率为：70.3、72.2、77.7、69.2、25；PCR阳性百分率分别为：59.2、77.8、71.4、70.7、75、78；基因探针杂交检测阳性率分别为：48.1、61.1、70.3、70.7、66.7、66.6、72.2。结论 cagA是胃、十二指肠疾病严重程度的标志，长臂光敏生物素标记的cagA基因探针具有特异性强、灵敏度高的特点，为临床检验中Hp强毒株分型检测的有效方法。
Preparation of cagA gene probe and its clinical application
XU Yihui, MI Keyong, LONG Yanhua. Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430072【 Abstract 】 Objective To investigate the relationship between cagA gene positive H.pylori and gastroduodenal diseases and the significance of the long arm photobiotin labelled cagA gene probe hybridizing detection in clinic.Methods We cloned the cagA gene fragment in pGEM-T vector, and amplified cagA fragment with the template——recombinant plasmid by PCR. Probes were prepared by labelling the fragment with the long arm photobiotin, and used to detect cagA+ H.pylori in 137 patients, taking rapid urease test (RUT) and PCR as contrast.Results The positive percentage in superficial gastritis, deep gastritis, gastritic ulcer, duodenal ulcer, chronic atrophic gastritis and gastric cancer, (%) were 70.3, 72.2, 77.7, 69.2 and 25 respectively by URT, 59.2, 77.8, 71.4, 70.7, 75 and 78 respectively by PCR, and 48.1, 61.1, 70.3, 70.7, 66.7, 66.6 and 72.2 respectively by cagA gene probe detection.Conclusions Statistics suggest that cagA+ H. pylori has a close correlation with gastroduodenal diseases in clinic, and can be a reliable predictor for high risk patients. The method of hybridizing detection with cagA gene probes, which labelled by the long arm photobiotin, is shown to be specific and sensitive , it is suitable for virulent strain typing identification in clinic.
【 Subject words 】 Helicobacter pylori cagA gene Clone Long arm photobiotin
Hp被认为是慢性胃炎，消化性溃疡的重要致病因子〔1〕及胃癌的协同致病因子〔2，3〕，Hp一旦感染人体，可在体内持续存在数十年，甚至终生。但Hp感染人群大多无症状，只有少数人会表现不同程度的症状，Hp存在不同毒力的菌株〔4，5〕是主要原因之一。cagA+株被大多数学者认为是强毒株，与消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌密切相关〔2，4〕。本研究旨在制备cagA基因探针以探针检测方法对cagA基因进行临床检验，以探讨cagA+Hp与胃肠道疾病的关系。
Hp虽有毒力差异，但尿酶试纸检验不能检测产毒Hp，Hp临床分型检验工作仅限于PCR和ELISA。目前，光敏生物素标记基因探针法已普及〔6〕，长臂光敏生物素标记探针也已开始应用〔7〕，光敏生物素标记基因探针安全、灵敏〔6〕，故本实验欲建立长臂光敏生物素标记cagA基因探针检验方法并探讨其临床应用意义。
材料与方法
1.主要试剂：IPTG、Xgal(Sigma)、pGEM-VECTOR、T4 DNA ligase、Taq DNA聚合酶、dNTP(华美生物工程公司)、长臂光敏生物素(中国军事医学科学院)、基因探针试剂盒(武汉中敏基因工程有限公司)。
2.菌株与临床标本：Hp菌株NCTC11637(含cagA基因)由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所提供。
3.cagA基因片段PCR扩增：DNA引物序列为〔8〕：引物1：5-GATAAGAGGGAAGCTTTTGA
GG-3(1 228～1 249nts),引物2：5-GTGCAAAATTGTTTGCGAGA-3(1 555～1 575nts),扩增片段长约349bp。模板DNA为NCTC11637菌株基因组核酸。PCR扩增条件：预变性95℃ 300秒，变性96℃ 50秒，退火56℃ 50秒，延伸73℃ 60秒，最后一次延伸73℃ 300秒，循环次数为30次。制备基因探针时的PCR模板为克隆菌重组质粒DNA，其PCR扩增条件同上。
4.pGEM-T载体制备：方法同参考文献〔9〕。
5.cagA基因片段克隆株的构建：将PCR扩增的cagA特异片段与pGEM-T载体用常规T4 DNA 连接酶方法连接构建重组质粒，转化入DH5α，方法同文献〔10〕，筛选同文献〔10〕，白色菌落为阳性菌落。
6.阳性克隆株鉴定：取阳性克隆株进行菌株纯化，再提取重组质粒进行如下鉴定：(1)PCR扩增：以克隆株重组质粒为模板，选用上述cagA基因片段的引物作PCR扩增，电泳观察扩增情况。(2)单、双酶切分析：用PstⅠ、SacⅡ作双酶切和PstⅠ单酶切，以λDNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ marker作标准电泳，观察酶切图谱。(3)核酸分子杂交鉴定：以重组质粒为模板，用合成cagA DNA 特异片段的PCR引物(同上述引物)进行PCR扩增，扩增产物用长臂光敏生物素标记制成基因探针，对重组质粒进行杂交鉴定，以人肺全基因、质粒pGEM-5Zf作阳性对照以NCTC 11637菌株的349bp长特异PCR产物作阳性对照，观察试验结果(蓝紫色为阳性，无色为阴性)。
7.cagA基因探针制备与检测仪器：按上述PCR方法扩增cagA基因片段，用光敏生物素标记制备基因探针，其全套试剂由武汉中敏基因工程公司提供。检测仪器为生物基因检测仪，亦由武汉中敏公司生产，使用方法按使用说明书进行。
8.临床标本处理：临床标本取自武汉市第三医院胃镜室，由内窥镜取得的病灶及周围处胃粘膜。每个病人同时取二块胃粘膜。一块作尿酶试纸反应，一块待作PCR及基因探针检测。病人年龄16～74岁。标本核酸抽提：取裂解液(Tris-HCl 10mmol/L,pH7.8，EDTA 5mmol/L，Tween-20 0.5%，NP40 0.5%)200μl加一块胃粘膜加蛋白酶K至200μg/ml，58℃水浴40～50分钟。用酚/氯仿、氯仿各抽提一次，再加3倍无水乙醇加1/10体积NaAC(3mol/L pH4.8)沉淀，离心去上清，自然干燥后加20μl TE溶解，分别作PCR及基因探针检测，PCR方法同前，探针杂交检测按武汉中敏基因公司提供产品使用说明书进行。
结果
1.菌种染色体DNA模板进行cagA基因片段扩增：如图1所示，特异性扩增DNA片段为349bp。
| 图1 以NCTC11637菌株基因组核酸为模板进行cagA基因扩增产物电泳结果
Fig 1. 1.5% Agarose electrophoresis of PCR products using NCTC11637 genome DNA as template 1.PCR markers 2,3,4,5.PCR products 2.以cagA基因片段重组质粒DNA为模板进行基因片段扩增：如图2所示，其扩增基因片段与菌种染色体DNA扩增片段同样为349bp左右，说明重组质粒含cagA基因片段。 |
图2 以cagA基因片段重组质粒DNA为模板的基因片段扩增产物电泳结果
Fig 2. 1.5% Agarose electrophoresis of PCR products using recombinant plasmid as template
1.NCTC11637 PCR product
2.Recombinant plasmid PCR product
3.PCR marker
3.重组质粒酶切分析：如图3所示，PstⅠ单酶切后的线状重组质粒片段在未重组线状质粒片段之后，说明有外源基因插入质粒，双酶切产生两个片段。大片段单酶切片段小，而小片段较349bp长，约400bp(克隆片段+60bp左右质粒片段)，说明克隆片段长约350bp。
图3 重组质粒酶切分析
Fig 3. Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid
1.Recombinant plasmid:cccDNA,DNA, ocDNA
2.Recombinant plasmid DNA digested with PstⅠ
3.Recombinant plasmid DNA digested with PstⅠ +SacⅡ
4.PCR product (about 349bp)using NCTC11637 genome DNA as tamplate
M. Marker
4.cagA基因探针杂交鉴定：如图4所示，说明重组质粒与NCTC11637菌种染色体DNA产生核酸斑点杂交反应，而入肺DNA、未克隆cagA基因的pGEM-5Zf质粒不产生核酸的杂交反应，结果说明重组质粒含cagA基因片段。
图4 cagA基因探针点杂交鉴定
Fig 4. Dot blotting of cagA geng probes
1,4.Recombinant plasmid
2.PCR product using NCTC11637 genome DNA as template
3.PCR product using recombinant plasmid DNA as template
5.Human lung genome DNA
6. pGEM-5Zf
5.病样检测结果：对137例病样的尿酶试纸检测、cagA PCR检测、cagA基因探针检测结果如表1。
表1 三种不同检验方法病样阳性结果
Table 1. The results for samples tested with three differeal diagnostic methods
| Group① | A | B | C | D | E | F |
| No.of patients | 27 | 18 | 21② | 41③ | 12 | 18 |
| No.positive by urease test(%) | 19(70.3) | 13(72.2) | 14(77.7) | 27(69.2) | 3(25) | / |
| No.positive by cagA PCR(%) | 16(59.2) | 14(77.8) | 15(71.4) | 29(70.7) | 9(75) | 14(78) |
| No.positive by cagA gene probe(%) | 13(48.1) | 11(61.1) | 14(70.3) | 29(70.7) | 8(66.7) | 13(72) |
①A:Superficial gastritis, B:Deep gastritis, C:Gastritic ulcer, D:Duodenal ulcer, E:Chronic atrophic gastritis, F:Gastritic cancer；②18 for RUT；③39 for RUT;RUT:Rapid urease test
从表1可见，B组～F组，较A组cagA+Hp阳性率明显升高，尿酶试纸阳性与疾病严重程度无明显相关性，PCR比探针检测阳性率稍高，但差异无统计学意义。
讨论
由本文结果可知，在有严重胃、十二指肠疾病的病人中，cagA阳性率明显较浅表性胃炎高，尤以胃癌高，可能与Hp菌数增多，病灶局部DNA模板量增大有关。其中，C组、D组阳性率偏低，可能是胃病灶部组织糜烂严重造成粘液层、粘膜上层深度损坏，不适于Hp定居造成。cagA基因表达产生相对分子质量为128×103的蛋白。有资料说明有cagA蛋白抗体的病人IL-8较高〔11〕。IL-8为主的强力细胞因子网可严重损伤消化道粘膜，而在非cagA基因携带的Hp感染病例中，通过IL-6、TNF-α的弱细胞因子网引起的粘膜损伤比较轻。故细菌细胞毒素作用和细菌感染引起的胃上皮炎症介导的损伤可能是溃疡形成的主要原因。而cagA蛋白导致不断的炎症反应和粘膜损伤，又促进胃部其它致癌因子对病灶细胞的侵袭，从而导致异型增生，并进一步发展成癌症。
总之，虽然cagA基因在致病中的具体作用还有待进一步研究，但该实验说明cagA基因是强毒株的标志，含cagA+Hp在溃疡发病早期起着重要作用。
有资料报道〔12〕说，对cagA+Hp的根除能显著改善胃炎和胃上皮细胞损伤状况，而对已产生肠化生和萎缩的病人的病情改善不明显。这说明对cagA+Hp的早期发现，早期治疗是防止因Hp引起的胃癌发生的重要措施。
本实验临床检验中，PCR阳性率较探针检测阳性率高，但对于一些存放过长的病样，探针检测阳性率较PCR高，其原因可能是其对模板核酸的完整性要求比PCR低。可见探针检测在病样存放时间上要求较PCR低。另外，PCR易产生模板或产物的交叉污染，为消除假阳性，需在很多步骤(如抽提核酸，加模板，加酶时)严格操作，而在探针检测中只需在抽提核酸时严格操作，以小牛胸腺封闭完全后不会有非特异吸附，从而可以避免假阳性。
本实验中采用长臂光敏生物素标记是因为生物素无放射污染，并且长臂光敏生物素标记率较生物素高，标记方便。采用克隆方法制备的重组质粒作探针制备模板，避免了Hp菌株的繁杂培养条件和过程，并且没有传染危险，核酸抽提也很方便。
实验过程中发现尿酶检测不仅阳性率不高，而且从尿酶试纸遇灭菌LB培养基变红可见其准确率不高，且无法对Hp分型。可见本实验建立的cagA+Hp探针检测方法具有简便、准确、灵敏的特点，有利cagA+Hp早检出、早治疗。但此杂交法中显色反应时间的控制与显色反应中酶的活力、浓度关系密切，故该检测操作过程中还存在把握好显色时间、酶液浓度的问题。
参考文献
1 周殿元主编.幽门螺杆菌与胃十二指肠疾病.上海：上海科学技术文献出版社，1993.
2 The EUROGAST Study Group.An international association between Helicobacter pylori and gastric cancer.Lancet,1993,341∶1359-1362.
3 Parsonnet J,Hansen S,Rodeignez L,et al.Hp infection and gastric lymphoma.N Eng1 J Med,1994,330∶1267-1271.
4 Nomura A,Stemmerman GN,Chyou PH,et al.Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma in a population of Japanese-Americans in Hawaii.N Eng1 J Med,1991,325∶1132-1136.
5 Potersen W.Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N Engl J Med,1991,325∶1127-1131.
6 Diamandis EP,Christopoulos TK.The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.Clin Chem,1991,37∶625.
7 王勇，牟兆钦，刘耀清，等.PCR结合长臂光敏生物素探针杂交检测幽门螺杆菌.中华微生物学和免疫学杂志，1996，16∶279.
8 Richard MP,Geraldine JR,Miller G,et al.Detection of Helicobacter pylori gene expression in human gastic mucosa.J Clin Microbiol, 1995,33∶28-32.
9 Douglas Marchuk,Mitchell Drumm,Ann Saulino, et al. Construction of T-vectors,a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products.Nucleic Acids Research,1991,19∶1154.
10 J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.第二版，北京：科学出版社，1992，55-57.
11 Yoshio Yamaoka,Masakazu Kita.Helicobacter pylori cagA gene and expression of cytokine messenger DNA in gastric mucosa. Gastroenterology,1996,110∶1744-1752.
12 Rene WM,Van Der Hulst,Guido NJ Tytgal.Effect of Helicobacter pylori eradication on gastritis in relation to cagA.A Prospection 1-Year Follow-up Study.Gastroenterology,1997,113∶25-30.
(收稿：1998-03-04 修回：1998-06-08)