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单克隆抗体：从80年代的魔弹到当今临床应用的主流——第七届国际人抗体和杂交瘤会议简介
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 国际会议简介
作者：董军 黄强
单位：苏州医学院第二附属医院
新型单克隆抗体的治疗性试验及开发的新方法构成了1999年9月8日～10日在英国爱丁堡召开的第七届国际人抗体和杂交瘤会议上讨论的核心问题。大会分新兴的抗体工程技术、分子生物学、自体免疫/变态反应性疾病、肿瘤、感染性疾病和临床应用等六个方面进行了专题报告。
一、新兴的抗体工程技术
核糖体展示技术(Ribosome display)的最新进展，其效率大大超过了近几年来广为应用的噬菌体展示技术。共有三篇来自瑞士苏黎士大学A.Pluckthun教授等人的报告分别从不同角度介绍了这一新技术。其核心是利用一体外核糖体表达载体，构建ScFv抗体库，并于体外转录为mRNA，体外翻译表达。随后以固相化的抗原分子亲和筛选核糖体-mRNA-ScFv复合物中高亲和力的ScFv。该技术克服了其它一些蛋白质筛选技术(如噬菌体展示)需转化细菌或真核细胞因效率不高而降低库容，减少抗体多样性的局限；并避免了宿主随细胞基因组复制过程中可能丢失而产生的库容下降；同时亦解决了因抗体筛选条件不利于宿主细胞生存而导致抗体丢失这一难题；由于其体外翻译、体外筛选的特点，大大缩短了实验周期，具有省时省力、方便快速的特点。
用于制备针对不同靶抗原的完全人抗体的转基因鼠的问世，是继噬菌体抗体库技术之后抗体人源化技术的又一重大突破。美国Abgenix公司的L.L.Green介绍了转基因鼠(Xenomouse)的基本特征，即鼠体液免疫系统的“人源化”：敲除鼠内源免疫球蛋白编码基因，代之以相应的人免疫球蛋白编码基因，并利用鼠与人体相似的抗体亲和力成熟机制，产生高亲和力的人抗体。该鼠能识别人体蛋白为异物，而产生针对该蛋白的人抗体。除此之外，该鼠与正常鼠无其他区别。目前最新的第二次转基因鼠制备过程如下：首先是构建两条酵母人工染色体(YAC)，酵母载体中包含编码人免疫球蛋白位点区的106 bp的大片段DNA。两条YAC是由一系列相互重叠的分别含有人重链或κ轻链位点区基因的YACs重组而成：一条YAC包含95个人重链可变区基因中的66个；另一YAC包含76个人轻链可变区基因中的32个。同时亦包括人轻重链恒区基因及已知的调控序列。再以含有二条YAC的球形酵母原生质体与敲除Ig编码序列的鼠胚胎干细胞(ES)融合，外源YAC整合到鼠染色体，分别获得7个和20个含有完整重、轻链YAC的ES克隆。然后将ES细胞导入鼠胚囊获得嵌合体，并以反复筛选交配最终获得可产生完全人抗体的鼠。分别以人IL-8，EGFR，TNF-α，CD4免疫该鼠，再以杂交瘤技术与鼠骨髓瘤细胞融合，经筛选获得了针对上述抗原的高效价人抗体杂交瘤细胞株，充分体现了该技术在解决人抗体制备时人体不能随意免疫这一难题的价值，其人源化程度及抗体亲和力均高于CDR区移植改形的人源化抗体，有极大的应用潜力。
以色列的R.Eren等制备抗HBV、HCV人抗体所应用的人-鼠辐射嵌合体鼠亦颇有新意。实验首先选用正常品系的小鼠给予近致死量的全身辐射以杀灭全身免疫细胞，再以SCID鼠骨髓干细胞移植辐射鼠后，该鼠对人体细胞和组织无排斥能力。然后移植抗-HBs阳性志愿者的淋巴细胞，并以乙肝疫苗免疫该鼠。经过鼠体内亲和力成熟过程，筛选高效价人B细胞与骨髓瘤细胞融合，从而获得稳定分泌高亲和力人抗体的杂交瘤细胞株。日本的Kawahara h则采用体外免疫技术，以人肿瘤细胞株体外免疫人淋巴细胞，随后以分泌高效价人IgG的B细胞与骨髓瘤细胞融合，制备高亲和力人单抗。
二、肿瘤的诊治应用
加拿大的J.Xiang等报告了单抗/细胞因子融合蛋白的基因工程制备及导向细胞因子治疗肿瘤的策略。他们采用基因工程技术构建了分别包含IL-2、IFN-γ和TNF-α3种细胞因子的F(ab′)2/细胞因子真核表达载体和ScFv/细胞因子原核表达载体，并分别于哺乳动物细胞和大肠杆菌中表达。体内试验证实，3种融合蛋白均能靶向结合表达肿瘤相关抗原的肿瘤组织，并抑制荷瘤动物模型中原发癌和转移癌的生长。因此，此类融合蛋白作为新一代免疫治疗药物在恶性肿瘤治疗领域具有较大的应用潜力。笔者也应邀报告了从两个杂交瘤细胞和一个噬菌体抗体库中筛选高亲和力抗人脑胶质瘤ScFv，并与人TNF-α成熟肽基因拼接，于大肠杆菌表达双功能抗体分子ScFv-hTNF-α。
美国的C.Somasundaram报告了一种同时识别实体瘤中常见靶抗原EGFR和HER2/neu的三特异性抗体(TsAb)的制备方法，及其在实体瘤治疗中的应用价值。作者采用化学交联法，以OPDM将抗淋巴细胞Fcγ受体I(即FcγRI/CD64)单抗(可有效激活T淋巴细胞)及抗EGFR和抗HER2/neu单抗的Fab片段偶连成三特异性抗体复合物F(ab)3。其偶连过程分两步进行，首先，抗FcγR1单抗m22和抗EGFR人源化单抗H425的Fab段偶连成双特异性抗体，得率为60%。然后抗HER2/neu鼠源单抗520C9的Fab段再与上述BsAb偶连，得率为40%。纯化后，TsAb的纯度达到90%。体外试验证实，TsAb与三种抗原特异结合，体内试验表明，TsAb能激活T细胞靶向杀伤表达相应肿瘤抗原的肿瘤细胞。与仅能识别一个肿瘤抗原的BsAb相比，TsAb可更高效地与两个肿瘤抗原结合，提高靶向杀伤效率。
Abgenix公司以人EGFR免疫采用转基因技术制备的能分泌人抗体的转基因鼠Xenomouse(见前述)，得到一株抗人EGFR特异性人单抗E.7.6.3(IgG2,κ)。该单抗具有高亲和力(KD=5×10-11M)，能够完全阻断EGF，TGF-α与表达EGFR肿瘤细胞的结合，并抑制EGF依赖的细胞激活，包括EGFR酪氨酸磷酸化，细胞外段酸化率的增加以及细胞增殖。小剂量应用E.7.6.3(0.2mg i.p 1周2次，持续3周)能够完全预防人表皮细胞瘤株A431于裸鼠体内致瘤。更有意义的是，仅给予E.7.6.3而不辅以化疗即能完全清除荷瘤动物体内已长至1.2cm3的肿瘤。在所有动物中三周内完全清除肿瘤，所需单抗总量仅为3mg，在65%的荷瘤鼠中单抗用量达到0.6mg时，肿瘤已完全被清除。从末次抗体注射起观察8个月，未见肿瘤复发。由于E.7.6.3为完全人抗体，与鼠源或人源化鼠抗体比较，其免疫原性最低，半衰期延长，因此可多次应用，并有力地证明了EGFR单抗疗法在治疗表达EGFR的多种人实体瘤的巨大价值。
三、治疗自身免疫疾病
以色列特拉维夫大学的Yehuda Shoenfeld教授主持了该分会场的专题报告，并3次应邀报告。他首先评述了粥样硬化作为自身免疫疾病体液免疫方面研究的进展，随后报告了系统性红斑狼疮病人中粥样硬化相关标记物的改变与体液免疫在促进动脉粥样化形成中的作用。最后报告了静脉注射γ免疫球蛋白疗法(IVIG)在诱导纤维化消退中的作用：纤维化是许多病理过程的终末改变，在一些罹患皮肤纤维化、慢性溶血性贫血、SIE、丙肝病毒所致的肝硬化、系统性硬化(以皮肤硬化为主)等疾病的患者，以常规治疗辅以IVIG，所有患者均有不同程度的纤维化消退，并最终延缓甚至逆转其原发病病程。作者指出，IVIG疗法起效的机制可能有调节细胞因子产生、影响粘附分子表达，抑制成纤维细胞浸润并诱导其凋亡等多种机制参与。
四、克隆技术
大会最后特邀了英国罗斯林研究所的Lan wilmut教授，专题介绍了体细胞克隆羊“多莉”的研究并展望了克隆技术在生产人单抗领域的应用。他认为，体细胞克隆技术虽获得成功，尚远未成熟，表现为效率低、约50%的胚胎死亡率、5%出生死亡率和20%新生羊死亡率等。但较先前的基因直接注射转基因法而言(低效、易引起突变、表达不稳定和仅能添加1种基因)，克隆技术中所应用的核转移技术的确是一个巨大的突破。展望该技术的应用前景，仍待解决的问题有：(1)证实其安全性；(2)能否取得克隆其它哺乳动物成功；(3)证实基因修饰在改善或改良表型的有效性。对于克隆人这一有争议的话题，Wilmut表达了自己独特的观点：克隆技术对解决不育问题、复制逝世的亲人以及制备经选择的超人服务人类等方面有重要意义。他最后总结，克隆技术将会很快应用于抗体制备领域，目前尚不能准确预测会在何时，但终将会为广大患者提供巨大的临床治疗机会。