cAMP对人骨髓瘤细胞的IL-6信号转导功能及细胞增殖的抑制作用

cAMP对人骨髓瘤细胞的IL-6信号转导功能及细胞增殖的抑制作用

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 基础免疫学

作者：宋伦　黎燕　沈倍奋

单位：军事医学科学院基础医学研究所

关键词：白细胞介素-6；多发性骨髓瘤；信号转导；cAMP

　　【 摘要 】　目的　研究PKA途径激活（或胞内cAMP水平升高）后对人骨髓瘤细胞的IL-6信号转导功能及细胞生长的影响。 方法　采用PKA途径激动剂Foskolin（FK）和cAMP类似物8-Br-cAMP刺激人骨髓瘤细胞系——Sko-007，分别通过MTT方法和凝胶阻滞电泳（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）方法检测FK和8-Br-cAMP对Sko细胞的生长及其IL-6信号转导功能的影响。 结果　FK和8-Br-cAMP可对Sko细胞的生长及其IL-6的Jak/STAT信号途径的活化起双重抑制作用，但对另一条IL-6信号途径——Ras/NF-IL-6途径的活化无显著影响。 结论　1. PKA途径的激活可调控骨髓瘤细胞系中IL-6的Jak/STAT信号转导途径； 2. Sko细胞中PKA途径激活所介导的细胞增殖抑制作用与IL-6的Jak/STAT信号途径的活化抑制作用相关。

cAMP inhibits the proliferation and IL-6 signal

　　transduction of multiple myeloma cell

SONG Lun, LI Yan, SHEN Beifen. Institute of Basic Medical Science, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, P.R.China

　　【 Abstract 】　Objective　To investigate the effect of PKA pathway activation (or increasing level of intracellular concentration of cAMP) on the growth and IL-6 signal transduction of the multiple myeloma (MM) cells. Methods　Human multiple myeloma (MM) cell line-Sko-007 were stimulated with the angonist of PKA-forskolin(FK) or the analogue of cAMP-8-Br-cAMP, the effect of FK and 8-Br-cAMP on cell proliferation and IL-6 signal transduction of Sko-007 cells were exhibited by MTT and electrophoretic mobility shift assay(EMSA). Results　FK and 8-Br-cAMP inhibited the proliferation and Jak/STAT pathway activation of Sko-007 cells, but had no regulatory effect on Ras/NF-IL-6 pathway. Conclusion　1.Jak/STAT pathway activation by IL-6 in MM cell line-Sko-007 can be regulated by cAMP. 2.The inhibitory effect on the proliferation of Sko cells mediated by the activation of PKA pathway is temporally related to the inhibition of JAK/STAT pathway activation by IL-6.

　　【 Subject words 】　Interleukin-6; Multiple myeloma; Signal transduction; cAMP

　　多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是一种晚期的B细胞肿瘤，来自于瘤细胞本身自泌的或骨髓基质细胞旁泌的IL-6是维持MM细胞生存和促进其生长的一种最重要的细胞因子^〔1〕。而IL-6的生物学功能都是通过活化靶细胞内IL-6信号转导途径并最终诱导相应靶基因的表达而实现的^〔2〕。因此研究MM细胞中的IL-6信号转导途径及其调控方式对于揭示出IL-6在MM中的致病机制具有重要意义。

　　目前的研究结果表明：IL-6的信号转导途径主要有两条——Jak/STAT途径和Ras/NF-IL-6途径。经典的PKA、PKC等信号途径一般不能在IL-6的刺激下诱导激活^〔3〕；但越来越多的实验证据显示：PKA途径的活化能够对某些类型IL-6效应细胞系的生长产生影响^〔4〕。这提示我们：PKA途径虽然不直接介导IL-6信号，但有可能对IL-6信号传递起调控作用。因此我们选择了MM细胞系——Sko-007作为靶细胞，观察了PKA途径的激活对细胞生长以及IL-6信号转导功能的影响。

　　材料与方法

　　主要试剂：重组人IL-6由军事医学科学院生物工程研究所提供；α-³²P-dATP购自北京福瑞公司；用于EMSA实验的寡核苷酸引物由本室合成（OPC柱纯化）；Forskolin和8-Br-cAMP购自Sigma公司，分别溶于DMSO和1mol/L氨水。

　　细胞系：人骨髓瘤细胞系Sko-007由本室保存，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养基传代培养。

　　FK和8-Br-cAMP对细胞生长的影响：将正常培养的Sko-007细胞用含10% FCS的1640培养基洗2次后以5×10⁴个/ml的细胞浓度悬浮，并接种入96孔板中（每孔100μl），然后加入梯度稀释的FK或8-Br-cAMP，最后用10%FCS-1640培养基将每孔体积补足至200μl，于37℃细胞孵箱中培养72h后加入MTT（5mg/ml，每孔15μl ），代谢6h后加入酸性SDS（含0.01mol/L HCl的10% SDS）溶液溶解过夜并于570nm处测定光吸收值。

　　细胞核蛋白提取：

　　1.细胞预处理及刺激：在进行实验前将正常培养的Sko-007细胞在0.5%～1% FCS的1640培养基中饥饿12～16h（过夜）。实验时，取2×10⁶～5×10⁶个细胞为一个样品，用预温至37℃的PBS溶液洗3遍，然后将其悬浮于1ml的PBS溶液中。在各样品中加入适当剂量的IL-6于37℃细胞孵箱中刺激10min，其间摇动几次以混匀细胞。

　　2.细胞裂解：刺激后细胞立即置于冰浴中冷却，并用冰冷PBS溶液（含1mmol/L NaF、1mmol/L Na₃VO₄）洗2～3遍，然后加入50～100μl的匀浆缓冲液（10mmol/L Hepes pH7.8，0.75mmol/L亚精胺，0.15mmol/L精胺，10mmol/L KCl，1mmol/L DTT，0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L EGTA，0.5mmol/L PMSF；临用前补加1mmol/L NaF、1mmol/L Na₃VO₄、1mmol/L Na₃P₂O₄、10μg/ml aprotinin，pepstin，leupepstin）冰浴作用10min，再加入1/10～1/5V的75%蔗糖溶液后混匀，12000×g离心10min后去除上清。

　　3.核裂解：在以上离心沉淀物中加入50～100μl的核提取缓冲液（50mmol/L Tris-Cl pH 7.5，420mmol/L KCl，5mmol/L MgCl₂，0.1mmol/L EDTA，2mmol/L DTT，10%蔗糖，20%甘油；临用前补加0.1mmol/L PMSF），4℃冰浴30min，12000×g离心30min，取上清即为核蛋白溶液。采用Bradford方法确定蛋白浓度^〔5〕。

　　凝胶阻滞电泳（EMSA）：

　　1.探针：用于本实验的DNA寡核苷酸探针为能够与转录因子STAT3结合的APRE和与NF-IL-6结合的NF-IL-6/ATF。上游引物的核苷酸序列分别为：APRE：5′CTT CTG GGA ATT CCT A 3′；NF-IL-6/ATF：5′GAG ATG ACG TAG TTT TCG CGC TT 3′。下游引物与上游引物互补。探针以常规方法掺入α-³²P-dATP标记，终浓度3μmol/L。

　　2.结合反应：根据蛋白浓度，在同一实验中取等量的核蛋白样品。结合反应体系中包括：核蛋白5μl；5×结合缓冲液（50mmol/L Tris-Cl，150mmol/L KCl，2mmol/L EDTA，10mmol/L MgCl₂，10mmol/L DTT，0.1% BSA，20%甘油，临用前补加1.5mmol/L PMSF）2μl；10mg/ml鲑精DNA 1μl。以上反应体系于4℃冰浴10min后加入同位素标记的寡核苷酸探针2μl（0.3～0.6pmol），室温作用20min后上样。

　　3.电泳：制备5%甘油-聚丙烯酰胺凝胶用于EMSA分析，电压8V/cm，电泳缓冲液为0.25×TAE，4℃电泳1～2h后压片，-70℃曝光24～72h后显影。

　　FK对IL-6信号转导途径的调控作用：在IL-6刺激前分别在细胞中加入不同剂量的FK并以等量的FK溶剂DMSO作为对照，于37℃细胞孵箱中预处理细胞0.5h后再加入IL-6刺激，其余步骤同核蛋白提取及凝胶阻滞电泳。根据EMSA实验中转录因子激活信号强弱的变化反映FK对IL-6信号转导功能的影响。

　　8-Br-cAMP对IL-6信号转导途径的调控作用：在刺激细胞时，将8-Br-cAMP和IL-6同时加入到细胞悬液中，以等量的8-Br-cAMP溶剂1mol/L氨水作为对照，于37℃细胞孵箱中作用1h后提取核蛋白（步骤同上）。由于IL-6信号的一过性激活，在每个样品中都加入终浓度为1mmol/L的Na₃VO₄以保持转录因子的持续性激活状态。

　　结果

　　1.IL-6诱导Sko-007细胞中转录因子STAT3和NF-IL-6活化：目前的研究结果表明，IL-6的生物学功能是由两条主要的IL-6信号转导途径介导的：Jak/STAT途径和Ras/NF-IL-6途径。因此我们首先用EMSA方法分别检测了参与以上这两条信号途径的转录因子STAT3和NF-IL-6在Sko-007细胞中的诱导活化情况。我们以分别能够与STAT3和NF-IL-6结合的DNA反应成分APRE和NF-IL-6/ATF作为探针，与不同浓度IL-6刺激后的Sko-007细胞核蛋白相互作用，结果如图1所示：在正常培养的Sko-007细胞中存在有NF-IL-6的组成性激活，IL-6刺激后其活化信号显著增强；而STAT3在IL-6刺激前处于非活化状态，IL-6刺激后出现了明显的活化信号。说明这两种转录因子所参与的IL-6信号转导途径都能在Sko-007细胞中诱导激活。

　　2.FK和8-Br-cAMP对Sko-007细胞的生长抑制作用：Forskolin（FK）是一种非常有效的PKA信号途径激动剂；而8-Br-cAMP也可以其良好的细胞膜通透性模拟PKA途径激活后胞内第二信使cAMP升高时的生理状态。因此二者都可用于研究PKA途径活化对细胞生长以及生物学功能的影响。我们将系列稀释的FK和8-Br-cAMP分别加入到Sko-007细胞中，72h后用MTT方法检测二者对Sko细胞生长情况的影响。结果显示：FK和8-Br-cAMP对Sko-007细胞的生长都表现出了明显的增殖抑制作用（图2）。ED50分别为5.1μmol/L（FK）和22μmol/L（8-Br-cAMP）。

　　3.FK对Sko-007细胞两条IL-6信号转导途径的调控作用：将不同浓度的FK先于IL-6 30min加入到Sko细胞中，然后在各样品中添加等量的IL-6进行刺激。EMSA结果显示：FK可以明显抑制Sko-007细胞中STAT3的诱导活化，1μmol/L时即可产生显著的抑制作用，100μmol/L时使STAT3的诱导活化信号完全消失。但同样的实验条件下，FK没有对NF-IL-6的活化信号产生显著影响。这说明FK只能抑制IL-6的Jak/STAT途径的诱导激活，对Ras/NF-IL-6途径的活化没有影响(图3)。

　　图1　IL-6诱导Sko-007细胞中转录因子NF-IL-6和STAT3活化

　　Fig 1. Activation of NF-IL-6 and STAT3 in Sko-007 cells by different dose of IL-6

　　Specific and non-specific bands are indicated by arrow and star，respectively

　　Lane 1-4: 0, 10, 50, 100ng/ml of IL-6

　　图2　FK（A）和8-Br-cAMP（B）对Sko-007细胞生长情况的影响

　　Fig 2. Effect of FK（A）and 8-Br-cAMP（B）on the growth of Sko-007 cells

　　图3　FK对Sko-007细胞中STAT3和NF-IL-6诱导活化状态的影响

　　Fig 3. Effect of FK on the activation of STAT3 and NF-IL-6 in Sko-007 cells by IL-6

　　Sko-007 cells were treated without (lane 1) or with 10ng/ml of IL-6(lane 2-5) after pre-incubation with 1, 10 and 100μmol/L FK (lane 3-5) or its solvent DMSO(lane 2), respetively.　　4. 8-Br-cAMP对Sko-007细胞两条IL-6信号转导途径的调控作用：我们将不同浓度的8-Br-cAMP和等量的IL-6同时加入到Sko-007细胞中进行刺激，EMSA结果与FK类似：8-Br-cAMP可对STAT3的诱导活化表现出明显的抑制作用，但对NF-IL-6的活化信号没有影响(图4)。

　　图4　8-Br-cAMP对Sko-007细胞中STAT3和NF-IL-6诱导活化状态的影响

　　Fig 4. Effect of 8-Br-cAMP on the activation of STAT3 and NF-IL-6 in Sko-007 cells by IL-6

　　Sko-007 cells were treated with 10ng/ml of IL-6(lane 1-5) in the absence(lane 1) or presence(lane 2-5) of 1mmol/L Na₃VO₄ and 5, 50 and 500μmol/L 8-Br-cAMP(lane 3-5) or its solvent NH₄OH(lane 2), respectively.

　　讨论

　　随着IL-6信号转导机制研究的不断深入，信号途径激活所对应的生物学效应以及信号调控已逐渐成为目前新的研究热点。IL-6的两条信号途径中，Ras/NF-IL-6途径的活化在很多类型的靶细胞上与IL-6所介导的细胞增殖相关^〔6〕；而Jak/STAT途径所介导的生物学功能至今为止仍没有很确定的研究结果^〔3〕，只有一家实验室证实了STAT3可以介导IL-6家族分子的调亡抑制功能^〔7〕。多发性骨髓瘤是一种公认的IL-6表达异常相关性疾病，但IL-6在MM细胞上的功能（例如增殖促进作用）究竟是由哪一条信号途径介导的，目前国际上仍没有进行深入研究^〔1〕。我们在MM细胞Sko-007中观察到了Ras/NF-IL-6途径能够以组成性激活方式存在，这与“Sko-007本身自泌IL-6（结果未显示）、同时IL-6基因启动子区域存在有NF-IL-6的结合位点”的研究结论一致。由此可见Ras/NF-IL-6途径的组成性激活介导了Sko-007细胞依赖于自泌IL-6的生存方式。而Jak/STAT途径虽然也能在Sko细胞中显著激活，但它所介导的最终细胞效应目前我们还不清楚。通过本文的实验结果，我们发现Sko细胞的增殖被FK和8-Br-cAMP抑制的同时，Jak/STAT途径的活化也受到抑制，这提示，Jak/STAT途径可能以另外一种未知的短暂方式与MM细胞的生长状态相关。

　　IL-6信号途径的调控比信号途径本身更复杂更精细。我们在Sko-007细胞中观察到了Jak/STAT和Ras/NF-IL-6途径之间存在复杂的相互调控方式（另文发表）。在本文中我们证实了PKA途径的活化可以调控IL-6的Jak/STAT途径的诱导激活（图3A，4A）。只是从图4A与图3A的结果比较中我们发现，FK对STAT3活化信号的抑制作用明显强于8-Br-cAMP；而8-Br-cAMP在各个浓度剂量（5μmol/L～500μmol/L）的作用效果基本相似，似乎达到了饱和状态。分析这可能是由于FK可以直接激活胞内PKA途径并使信号得以放大，而8-Br-cAMP由于细胞膜通透性、细胞内稳定性等原因只能达到一定的细胞内浓度，因此只能产生一定限度的生物学作用。

　　参考文献

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(收稿日期：1999-08-05)