嗜酸性粒细胞可作为抗原呈递细胞

嗜酸性粒细胞可作为抗原呈递细胞

中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 基础免疫学

作者：施焕中　姜海行

单位：530021 南宁，广西医科大学第一附属医院内科

关键词：嗜酸细胞；抗原呈递细胞；淋巴细胞

　　【 摘要 】　目的　探讨HLA-DR⁺嗜酸性粒细胞（EOS）在体外培养条件下作为抗原呈递细胞（APC）将破伤风类毒素抗原（TT）呈递给T淋巴细胞的能力。方法　新分离的EOS经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子刺激24小时，以诱导HLA-DR的表达，然后将其暴露于不同浓度的TT，检测HLA-DR⁺EOS对自身T细胞增殖反应的影响，以评价EOS呈递抗原的能力。结果　HLA-DR⁺EOS于TT存在时可以明显促进T细胞的增殖反应，并与TT的浓度呈剂量相关性。而抗HLA-DR单克隆抗体则可以明显地抑制EOS的抗原呈递过程。结论　人EOS可以摄入和处理抗原并能将其传递给自身T细胞，而EOS呈递抗原的过程具有明显的HLA-DR依赖性。

　　Eosinophils function as antigen-presenting cells 　SHI Huanzhong, JIANG Haixing. Department of Internal　Medicine, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021

　　【 Abstract 】　Objective　To examine the capacity of HLA-DR expressing eosinophils to serve as antigen-presenting cells (APC) for presenting antigen tetanus toxoid to autologous T lymphocytes.Methods　 Freshly isolated eosinophils were cultured in vitro for 24 hours with granulocyte-macrophage colony factor to induce HLA-DR expression, and then exposed to different concentrations of tetanus toxoid. The capacity of HLA-DR⁺ eosinophils to function as APC was evaluated with the response of T cell proliferation induced by eosinophils.Results　HLA-DR⁺eosinophils stimulated T cell proliferation in the presence of tetanus toxoid in a dose-dependent manner. It was also found that the T cell proliferation response elicited by eosinophils was inhibited by anti-HLA-DR monoclonal antibody.Conclusion　Human eosinophils can uptake and process antigen and function as HLA-DR-dependent APC in stimulating T lymphocyte response.

　　【 Subject words 】　Eosinophils　　Antigen-presenting cell　　Lymphocyte

　　嗜酸性粒细胞（EOS）作为变态反应主要效应细胞，一般认为其功能与其所产生和释放的化学性递质、颗粒相关蛋白和某些细胞因子有关。然而，自从发现成熟EOS具有表达Ⅱ类主要组织相容性复合体基因（MHC）所编码的HLA-DR蛋白^〔1〕的能力以来，EOS 作为抗原呈递细胞（APC）的研究日益受到重视。本研究观察了EOS在体外培养条件下将破伤风类毒素抗原（TT）呈递给自身T淋巴细胞的能力。

　　材料与方法

　　1.EOS分离：为分离纯化的EOS，240ml枸橼酸盐抗凝的静脉血取自3名健康志愿者和3例对花粉或粉尘螨过敏的患者，每50ml枸橼酸盐抗凝的静脉血与10ml 6%的葡聚糖混匀后直接于60ml的注射器内倒立静置45分钟，收集富含白细胞的血浆，缓缓置于Ficoll-Hypaque（购自瑞典Pharmacia公司）之上，室温下250×g离心20分钟。收集沉积于管底的粒细胞和红细胞于另一50ml之离心管，加入10ml 0.2%氯化钠溶液，将红细胞溶解后再加等体积1.5%氯化钠溶液至等渗。粒细胞则与CD16、CD14和CD3微珠（均购自美国Miltenyi Biotec公司）4℃下孵化30分钟后，经MACS分离柱（美国Miltenyi Biotec公司产品）剔除CD16⁺中性粒细胞和少量残存的CD14⁺单核细胞和CD3⁺T细胞。形态学检测表明,所分离的EOS纯度均＞99%，台盼蓝排除试验表明99%以上的EOS是活细胞。为诱导EOS表达HLA-DR，新分离的EOS均于加有终浓度为100pmol/L的人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的细胞培养液（RPMI 1640辅以10%人AB型血清、2mmol/L谷氨酰胺、10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素）在5% CO₂潮湿环境中37℃培养24小时。

　　2.T细胞分离：为得到新鲜分离的自体T细胞，抽血分离EOS的6名志愿者均分别于次日复抽取静脉血80ml，并按上述方法收集血浆后同样缓缓置于Ficoll-Hypaque之上，室温下250×g离心30分钟。收集位于血浆与Ficoll-Hypaque之间界面的单一核细胞层，以冷Hanks缓冲液（HBSS）洗涤2次后通过CD3 T细胞分离柱（购自美国P&D System）即得到纯化的T淋巴细胞。分离方法系根据产品所附的说明书进行操作。

　　3.HLA-DR表达的检测：将10⁵新分离或经GM-CSF刺激的EOS悬于100μl含有牛血清蛋白（1g/L）和叠氮钠（0.1g/L）的HBSS中，分别与20μl藻红蛋白标记的抗HLA-DR单克隆抗体（单抗）和IgG2a对照蛋白(均购自于美国Becton Dickinson公司）于4℃孵化30分钟后，以同样的HBSS洗涤2次再以0.5%多聚甲醛固定。24小时内以FACStar Plus流式细胞仪及Consort软件（均为美国Becton Dickinson 公司产品）分析EOS所表达的HLA-DR。

　　4.EOS呈递抗原：为观察不同数量EOS在同一抗原浓度条件下刺激T细胞增殖的能力，将不同数量的（详见结果所述）的HLA-DR⁺EOS和10⁵T细胞共同置于96孔细胞培养板中，培养液同上。TT（购自美国Massachusetts Department of Public Health）终浓度为20mg/L。为观察不同剂量TT对T细胞增殖反应的影响，各孔细胞均为5×10⁴EOS和10⁵T细胞，各组TT终浓度分别为0.1mg/L、1mg/L、10mg/L和100mg/L。在部分实验中，5×10⁴EOS在和10⁵T细胞共同培养之前先与终浓度为100mg/L的抗HLA-DR单抗（购自美国American Type Curltre Collection）或IgG1对照抗体孵化2小时，以观察抗HLA-DR单克隆抗体的封闭作用。上述细胞培养板置于5% CO₂培养箱中潮湿环境下37℃培养96小时，于最后24小时每孔加入37kBq/L的³H胸苷。收获细胞后以射线液闪计数仪测定T细胞DNA合成所结合的³H胸苷量（以cpm表示），此即为T细胞的增殖能力。以上所有各项实验均3管测定，结果以均数±标准差表示。在每一个单独的实验中，如果在某种条件下所测得的cpm值等于或大于对照组（即不加入TT或EOS数为零）cpm的3倍，即认为T细胞出现增殖反应。

　　结果

　　1.HLA-DR在EOS的表达：新分离的EOS不表达或仅表达极低水平的HLA-DR蛋白(0～12.2%，平均4.8%）（图1和图2）。EOS于加有终浓度为100pmol/L的GM-CSF培养液中体外培养24小时，来自6名不同志愿者的EOS均表达较高水平的HLA-DR（25.2%～78.6%，平均49.5%）。

图1　以流式细胞仪检测新分离(A)和经GM-CSF刺激(B)的嗜酸性粒细胞表达的HLA-DR结果比较

　　Fig 1. Flow cytometry of freshly isolated eosinophils (A) and GM-CSF-treated eosinophils (B)

　　Thin line:Control IgG2a;Thick line:Anti-HLA-DR monoclonal antibody

图2　6名志愿者嗜酸性粒细胞经GM-CSF刺激前后表达HLA-DR结果比较

　　Fig 2. HLA-DR expression on eosinophils obtained from six donors before and after gM-CSF stimulation

　　2.不同EOS细胞数对呈递抗原的影响：从图3可以看出，仅加入TT而不加EOS时，T细胞并无增殖反应；EOS数增至10⁴时，T淋巴细胞仍不出现增殖反应，亦即如此低数量的EOS并不能将TT呈递给T细胞。当EOS数增至2.5×10⁴时，即可观察到T细胞所结合的³H胸苷明显增多，至5×10⁴和10⁵时，T细胞呈现更明显的增殖反应。图3表示6次独立实验中的1次结果，其余5次实验结果与此相同。

图3　不同数量HLA-DR阳性嗜酸性粒细胞呈递抗原能力比较

　　Fig 3. Efficiency of different numbers of HLA-DR positive eosinophils as antigen-presenting cells

　　3.不同剂量抗原对T细胞增殖的影响：图4代表结果相同的6次独立实验中的1次结果。可以看出，EOS将TT呈递给T细胞的能力与TT浓度密切相关。当TT的剂量低至0.1mg/L时，所测得的cpm值极低，实际上为背景值；TT的浓度增至1mg/L时，cpm值开始升高；当TT的浓度增至10mg/L和100mg/L时，cpm值则显著升高。

图4　不同浓度抗原对自身T细胞增殖反应的影响

　　Fig 4. Effects of different doses of antigen tetanus toxoid on autologous T lymphocyte proliferation response

　　4.HLA-DR和抗原呈递之间的关系： 当考察HLA-DR表达与EOS呈递抗原之间的关系时，我们注意到，来自6名志愿者新分离纯化的EOS，由于不表达或仅表达极低水平的HLA-DR而均不能将TT呈递给T细胞。经GM-CSF刺激24小时后，一名志愿者的EOS表达HLA-DR的阳性率为78.6%，将此EOS(5×10⁴)与自身T细胞（10⁵）在含有20mg/L　TT的培养液中共同培养时，所测得的cpm值为8 500±655；而另一名志愿者的HLA-DR⁺EOS为25.2%，同一条件下测得的cpm值为3100±292，分析其他志愿者的资料，也得出与此完全相同的结果。可见，HLA-DR表达的水平越高，EOS呈递抗原的能力就越强。图5显示，IgG1对EOS呈递抗原无任何影响，相反，抗HLA-DR单抗则可以明显地抑制EOS的抗原呈递过程。

图5　抗HLA-DR单抗可抑制HLA-DR阳性嗜酸性粒细胞所诱导的T细胞增殖反应

　　Fig 5. HLA-DR positive eosinophil-induced T lymphocyte proliferation response can be inhibited by anti-HLA-DR monoclonal antibody

　　讨论

　　早在本世纪60年代就发现，给豚鼠皮下注射同位素标记的抗原后不足24小时，摄入了抗原的EOS即聚集到局部引流的淋巴结^〔2〕。当时只是注意到此种现象，至于EOS 摄入抗原后如何处理，是否将所处理的抗原信息传递给其它免疫细胞则未作进一步研究。直到1989年，Lucey等人^〔1〕证实，成熟EOS于体外培养时在GM-CSF等细胞因子的刺激下能够表达HLA-DR之后，才提出EOS其实可以作为APC，从而在T细胞所介导的多种免疫反应中具有独特的作用。

　　已经认识到，APC要呈递抗原必须具备两个条件：第一，APC所呈递的蛋白质抗原多肽片段必须结合到MHC分子以便T细胞受体得以识别^〔3〕，因此，APC必须表达HLA-DR；第二，抗原一旦结合到T细胞受体，APC必须提供所谓共同刺激信号以诱导T细胞活化、增殖以及产生一系列细胞因子，抗原的呈递过程才得以完成^〔3,4〕。本研究结果显示，来自正常人或过敏体质的EOS如不经GM-CSF刺激，便不表达或仅表达极低水平的HLA-DR，EOS在体外培养经GM-CSF刺激24小时后，即可表达高水平的HLA-DR。这些结果和国外的报道基本一致。此外，早有研究表明，EOS也表达某些共同刺激因子如CD40^〔5〕。这就说明EOS具备了成为APC所需要的条件。

　　预实验结果表明，当以新分离的EOS与T细胞共同培养时，即使加入高浓度的TT，亦未观察到T细胞出现任何增殖反应。出现这种结果的原因是：新分离的EOS尚未表达足够的HLA-DR。在本实验中，我们发现表达了HLA-DR的EOS达到一定数量后即能将TT呈递给T细胞而促使后者利用³H胸苷合成DNA的能力大为增强，亦即出现了明显的增殖反应，EOS呈递抗原的能力随着数量的增多而明显增强。我们还发现，EOS将TT呈递给T细胞的能力与TT的浓度有关，TT浓度越高，T细胞的增殖反应就越明显，呈现明显的剂量相关性。这些结果表明，EOS表达HLA-DR后可以摄入和处理抗原，并将其呈递给T细胞。此外，HLA-DR表达的水平越高，EOS呈递抗原的能力就越强。HLA-DR单抗还可以抑制EOS的抗原呈递过程。这些资料提示，EOS呈递抗原具有明显的HLA-DR依赖性和MHC限制性。既然EOS可以作为APC，那么，EOS还可能以与此有关的机制参与哮喘的发病过程。尽管气道中树突状细胞和B细胞也是高效的APC，但这两种细胞仅能呈递可溶性抗原^〔6〕，而从目前看来，可溶性抗原与哮喘的关系不大，因为吸入性抗原多为颗粒性抗原。虽然肺泡巨噬细胞也可以吞噬颗粒抗原，但其本身不仅不呈递抗原，反而抑制其它APC的功能^〔7,8〕。尽管生理状态下体内EOS不表达HLA-DR，但哮喘发病时气道EOS表达高水平的HLA-DR^〔9〕。因此，哮喘时唯有浸润到气道的EOS适合于处理进入气道的颗粒性抗原并将其传递给T细胞，并将其激活。

　　综上所述，我们的结果表明，EOS经GM-CSF刺激诱导HLA-DR表达后能够将TT抗原呈递给自身T淋巴细胞，从而促使其增殖，而EOS呈递抗原的过程具有HLA-DR依赖性和MHC限制性。

　　本课题受广西壮族自治区科委资助(项目号：9532012)

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(收稿：1998-04-10　　修回：1998-09-28)