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致肾盂肾炎大肠杆菌papA基因的克隆及序列分析
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第3期第20卷 细菌学
作者：陈锦英 康宁 李方涛
单位：天津医科大学微生物教研室
关键词：肾盂肾炎；大肠杆菌；papA；聚合酶链反应
【 摘要 】 目的 对致肾盂肾炎大肠杆菌(UPEC)132株的papA基因进行克隆和序列分析。 方法根据F13型papA基因序列设计引物，并在二引物5′端加上限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ的酶切位点。采用此引物扩增132菌株p菌毛粘附基因群的papA基因， 扩增产物克隆入质粒，选取阳性重组质粒进行核苷酸序列分析。 结果 UPEC132株经PCR法扩增获得约700bp的papA片段，经克隆获得阳性重组质粒pCT20，对其进行序列分析显示papA 编码184个氨基酸多肽，与UPEC J96株papA相比较同源性达98%以上，于+43位和+73 位的错义突变对该菌毛的免疫学特性没有影响，保守的信号肽序列-16位出现同义突变，-3位缺失三联体密码使-1，-3位切割三联体由ANN变为ANV。 结论 papA信号肽序列变异可能影响其正确的切割，致使132株(Mr为16.6×103)和J96株(Mr为19.6×103)p菌毛蛋白的相对分子质量不同。
Cloning and sequencing of papA gene from uropathogenic Escherichia coli
CHEN Jinying, KANG Ning, LI Fangtao. Department of Microbiology, Tianjin Medical University, Tianjin, P.R.China Corresponding author: CHEN Jinying, Department
of Microbiology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070
【 Abstract 】 Objective The papA gene of uropathogenic Escherichia coli(UPEC) strain 132 was subjected to DNA cloning and sequencing. Methods A pair of oligonucleotide primers were designed according to the DNA sequence of F13 serotype papA, each of them included EcoRⅠor BamHⅠrestriction site at their 5' end. The papA gene was amplified from the pilus adhesive cluster of UPEC132, and then was cloned into plasmid pUC18. The recombinant plasmid was identified and subjected to DNA sequencing. Results The recombinant plasmid carrying a 700bp-long PCR product was purified and designated pCT20. The sequence analysis revealed that a 184-amino acid-long polypeptide could be translated. The overall homology between UPEC132 and J96 was above 98%. Two missense mutations at +43 site and +73 site were demonstrated, but they seemed to exert no influence on p pili's immunological property. By the analysis of the amino acid sequence of the conservative signal peptide, it was showed that a synonymous mutation at -16 site, as well as a deleted codon at -3 site occurred, the latter changed the -1,-3 cleavage triplet from ANN to ANV. Conclusion The variation in the signal peptide sequence can affect the accurate cleavage of papA mature polypeptide of UPEC132 and account for its molecular weight difference between UPEC132 and J96, which were 16.6kD and 19.6kD, respectively.
【 Subject words 】 Pyelonephritis; Escherichia coli; papA; Polymerase chain reaction; Sequence analysis
大肠杆菌是肾盂肾炎的主要致病菌，80%～100%的菌株具有p菌毛，能与泌尿道上皮细胞表面的p血型抗原物质特异性结合，是形成上行性感染的关键，称其为致肾盂肾炎大肠杆菌(pyelonephritic E.coli or uropathogenic E.coli, UPEC)。编码p菌毛的粘附基因群位于UPEC的染色体上，由11个基因组成，其中papA是编码p菌毛蛋白亚单位的结构基因，与该菌的致病和免疫保护作用密切相关。papA的核苷酸序列国外已有报道〔1，2〕，国内尚处于空白。我们曾对临床分离的UPEC132株进行了初步研究，其p菌毛属于F13型，菌毛蛋白相对分子质量为16.6×103，与国外相同血清型p菌毛有差异〔3〕，为了进一步研究编码基因的结构和为防治工作奠定基础，我们采用PCR定向克隆技术对该菌株的papA基因进行了克隆和测序分析。
材料和方法
菌株、质粒和培养基：UPEC132菌株由临床肾盂肾炎病人尿标本分离，经血凝、血清学和免疫电镜鉴定其p菌毛为F13型。F13型代表株E.coli J96和无菌毛代表株E.coli K-12 p678-54为RA Hull惠赠。E.coli DH5α为本实验室保存。质粒载体pUC18购自天象人生物工程公司。实验中使用LB液体和固体培养基，质粒抗性选择培养基含氨苄青霉素浓度为50mg/L。
试剂和仪器：限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ（中国协和医科大学科学技术开发公司）；Taq DNA聚合酶（Promega，美国）；T4 DNA连接酶（GIBCO，美国）；蛋白酶K（Merck，德国）；IPTG、X-gal（Sigma，美国）；DNA扩增仪（PE480）。
PCR引物的设计与合成：根据发表的F13型p菌毛的papA基因序列〔1〕，设计了一对寡核苷酸引物分别对应于该基因的5′端和3′端。为了定向克隆的需要，在二引物的5′端加上了限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，引物序列为：P1：5′CGGGAAT
TCGATAAATAACCTGCCCTGA(下划线处为EcoRⅠ识别序列)；P2：5′CCGGATCCGGATTATCAGTATTACTGA(下划线处为BamHⅠ识别序列)。引物由军事医学科学院生物工程研究所合成。
papA的PCR扩增：
1.模板DNA的制备：提取大肠杆菌染色体DNA作为模板。取1.5ml过夜培养菌液，离心后悬于0.5ml裂解液（TE pH8.0，0.5%SDS和蛋白酶K 50μg/ml）中，55℃水浴1h后用等体积饱和酚，酚/氯仿和氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于蒸馏水中。
2.反应系统：10×扩增缓冲液10μl ，MgCl2 1.5mmol/L，4种dNTP 200μmol/L，2种引物各100pmol，模板DNA 10ng，加ddH2O至100μl。混匀后加入Taq DNA聚合酶2.5U和石蜡油50μl，离心10min。
3.PCR反应条件：94℃ 5min，55℃ 2min，72℃ 3min，1个循环；94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 3min，2个循环；94℃ 1min，65℃ 2min，72℃ 3min，27个循环；然后于72℃延伸7min。取10μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果。试验中设E.coli J96为阳性对照，E.coli K12 p678-54为阴性对照。
DNA重组〔4〕：将扩增的UPEC132株的papA基因的全长DNA分别用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ消化后进行琼脂糖凝胶电泳，透析带回收目的DNA，并用相同的方法制备载体pUC18。处理过的插入片段和载体DNA按1∶1的量在T4 DNA连接酶催化下于16℃连接16h，转化处于感受态的E.coli DH5α，在IPTG和X-gal显色性标志下37℃孵育，筛选白色菌落，以碱变性法快速提取重组pUC18质粒。经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶消化和PCR法鉴定重组情况。
papA基因的序列分析：采用ABI 373A测序仪对重组质粒上的插入片段papA DNA自动测序，在军事医学科学院生物工程所完成。
结果
1.UPEC132株papA基因PCR扩增鉴定：用引物P1和P2扩增UPEC132株p菌毛粘附素基因群中papA DNA，产生了预期的约700bp特异产物带，阳性对照E.coli J96经同样操作产生完全相同的DNA带，而阴性对照E.coli K-12 p678-54和E.coli DH5α不被该引物所扩增（见图1）。
图1 PCR扩增产物的电泳检测
Fig 1. PCR amplification result of papA gene
1. Molecular marker(λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ)；2. UPECJ96； 3. UPEC132；4. pCT20；5. E.coli K-12 p678-54；6. E.coli DH5α
2.UPEC132株papA基因扩增产物的克隆及鉴定：用PCR扩增的UPEC132株papA DNA和质粒载体pUC18连接后转化给E.coli DH5α，经含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的培养基筛选，共得到4个阳性重组子，继而再经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，其中有3个重组质粒可得到2.69kb的载体DNA带和700bp大小的插入片段DNA带，并用PCR法可扩增出与原插入片段大小相同的DNA带，说明UPEC132株papA PCR产物成功地克隆到载体pUC18质粒中，选择其一命名为pCT20(见图1,图2）。
3.UPEC132株papA重组质粒pCT20序列分析：pCT20插入的编码p菌毛蛋白亚单位结构基因papA序列分析的结果表明，它由698个碱基对组成，具有典型的原核基因结构特征。起始密码子ATG位于碱基130～132处，终止密码子TAA位于碱基682～684处，TAA稍后又紧跟着两个框架内的终止密码子TGA和TAA，从起始密码子到终止密码子共翻译184个氨基酸组成的蛋白质。在ATG上游16碱基起始由-AAAGAGGT-组成公认的核糖体结合位点（即S-D序列）。推导信号肽序列由成熟肽的NH2-端丙氨酸上游的21个密码子组成，特征性正电荷赖氨酸残基位于-19位。UPEC132株的papA序列分析符合已有报道的规律，由核苷酸序列推导氨基酸组成分为4个部分，即NH2-端(R1～R21），Cys-Cys环区（R22～R61），可变区（R62～R153）和COOH-端（R154～末端），其中NH2-端、COOH-端和信号肽序列为遗传高度保守区域。与相同血清型代表株E.coli J96基因序列〔1〕相比较，后者由701个碱基组成，翻译氨基酸残基数为185个，两者核苷酸序列同源性为99.1%，推导氨基酸序列同源性为98.4%。两者起始密码子、终止密码子和S-D序列均相同，而信号肽序列J96株由22个密码子组成，132株由21个密码子组成，后者在-16位出现编码Ile的同义突变（ATT→ATC），在-3位缺失了编码Asn的密码子AAT，于是papA信号肽序列-1，-3位切割三联体J96株为ANN，132株为ANV。此外，UPEC132株Cys-Cys环区+43位出现错义突变Leu→Pro残基（CTT→CCT），可变区+73位也出现错义突变Lys→Gln(AAA→CAA）（见图3）。
图2 重组质粒pCT20的酶切鉴定
Fig 2. Analysis of the recombinant plasmid pCT20 with restriction endonuclease
1. Molecular marker (λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ)；2. PCR product of UPEC J96；3. pCT20；4. pCT20/BamHⅠ+EcoRⅠ；5. pUC18；6. pUC18/BamHⅠ+EcoRHⅠ；7. Molecular marker(λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ)
图3 papA基因测序结果
Fig 3. DNA sequences of the papA structual gene
Line 1: The papA DNA sequence of UPEC J96 strain; Line 2: The papA DNA sequence of UPEC132 strain (nucleotide identity with the papA sequence of J96 strain is indicated by-; the deleted codon is indicated by ...); Line 3: Amino acid sequence of the predicted polypeptide product of UPEC J96 (amino acid different from that of UPEC132 is marked with·)
讨论
肾盂肾炎是常见病，尤以妇女和儿童较多见，治疗不当预后欠佳。UPEC p菌毛的粘附作用是致病过程的先决条件，编码p菌毛的粘附基因群（或称pap操纵子）位于UPEC的染色体上，至少编码10种多肽参与p菌毛的生物合成。p菌毛本身由数以千计的主要菌毛蛋白亚单位（PapA）和3种位于菌毛尖端的次要菌毛蛋白（PapE、PapF和PapG）组成。PapA是papA基因的表达产物，约占菌毛纤维总量的99.9%，具有高度的免疫原性，基于PapA的多肽疫苗在试验性动物感染模型中可有效地清除尿道同源性或异源性的UPEC菌株〔2，5〕。因此，papA在致病机理和免疫保护作用的研究中具有重要的意义。
根据抗原性的不同，p菌毛可分为7～8个血清型，已有5个血清型（F71、F72、F9、F11和F13型）的papA基因被克隆和测序〔1,2〕，但在同一血清型中papA序列分析的研究未见报道。我们曾用UPEC J96 p菌毛抗血清经ELISA 、免疫电镜和Western blotting鉴定UPEC132的p菌毛为F13型，其菌毛蛋白相对分子质量为16.6×103，与J96株（19.6×103）不同〔3〕。为了探讨两者基因水平的差异，我们首次用PCR定向克隆方法克隆了UPEC的papA基因并进行了序列分析。与J96株papA核苷酸序列相比较，132株在编码免疫原性表位的Cys-Cys环区和编码抗原性表位的可变区各出现了一个氨基酸残基的错义突变，看来并不影响UPEC132株菌毛的免疫学特性。令人感兴趣的是UPEC132株papA的信号肽序列中最为保守的信号肽酶识别窗口（即C区）-3位缺失了三联体密码AAT，为此按照-3、-1规则切割三联体由J96株的ANN变为132株的ANV，即-3位的切割位点由天冬酰胺残基变为缬氨酸残基，这种改变难以用PCR扩增中Taq DNA聚合酶可能出现的碱基错掺来解释〔6〕。根据J96株papA序列推导成熟肽实际的相对分子质量为19.5×103，与试验结果的报道基本一致〔3〕。因此，两个菌株p菌毛蛋白相对分子质量的差异是否与UPEC132株papA信号肽序列变异造成的不准确切割有关尚需进一步研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.39470040)
参考文献
1 Båga M, Normark S, Hardy J, et al. Nucleotide sequence of the papA gene encoding the Pap pilus subunit of human uropathogenic E.coli. J Bacteriol, 1984, 157(1):330-333.
2 Denich K, Blyn LB, Craia A, et al. DNA sequences of three papA genes from uropathogenic E.coli strains : evidence of structural and serological conservation. Infect Immun, 1991, 59(11):3849-3858.
3 陈锦英, 杨惠彬, 何建民,等. 致肾盂肾炎大肠杆菌粘附特性的研究. 微生物学通报, 1995, 22(1):32-35.
4 金冬雁, 黎孟枫, 译. 分子克隆 实验指南. 第二版. 北京:科学出版社, 1996, 34-74.
5 Schmidt A, O Hanley P, Lark D, et al. Synthetic peptides corresponding to protective epitopes of Escherichia coli diaglactoside-binging pilin prevent infection in a murine pyelonephritis model. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:1247-1251.
6 金冬雁,金奇, 侯云德. 核酸和蛋白质的化学合成与序列分析. 北京:科学出版社, 1996, 134-136.
(收稿日期：1999-03-19)