小鼠MAdCAM-1分子剪切体的克隆及表达

小鼠MAdCAM-1分子剪切体的克隆及表达

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基础免疫学

作者：张慧英　高杰英　罗振革　刘永全　彭虹　陈志华　孔祥英

单位：军事医学科学院微生物流行病研究所

关键词：粘膜血管定居因子；蛋白表达

　　【 摘要 】　目的　获得小鼠粘膜血管定居因子(MAdCAM-1)分子剪切体cDNA，并在原核细胞中进行有效表达。方法　 从BALB/c小鼠的肠系膜淋巴结中提取总RNA，利用RT-PCR方法获得小鼠MAdCAM-1分子剪切体cDNA，构建原核表达载体并进行表达，纯化融合蛋白制备多抗。 结果　核酸序列分析表明获得了正确的小鼠MAdCAM-1分子剪切体cDNA；小鼠MAdCAM-1剪切体以融合蛋白的形式得到表达，主要以包涵体形式存在；免疫印迹分析表明，小鼠MAdCAM-1剪切体蛋白可被小鼠MAdCAM-1分子的标准单抗及自制多抗识别。 结论　 小鼠MAdCAM-1剪切体cDNA、表达蛋白及多抗的获得，为进一步研究该分子的生物学活性做好准备。

Cloning and protein expression of mouse MAdCAM-1 spliced variant

ZHANG Huiying, GAO Jieying, LUO Zhen′ge

　　（Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100850, P.R.China）

　　【 Abstract 】　Objective　To obtain the spliced mouse mucosal addressin cell adhesion molecule-1 (mMAdCAM-1) cDNA and express it in E.coli. Methods　Obtaining the spliced mMAdCAM-1 cDNA from mesenteric lymph nodes of BALB/c mice by RT-PCR, cloning the cDNA into the procaryotic expressive vector pGEX-2T and expressing the fusion protein. Results　After identified by DNA sequencing, the fusion protein was expressed and mainly existed as inclusion bodies. After purification, we prepared the multi clonal-antibody to the fusion protein. The spliced mMAdCAM-1 protein was identified by the multi clonal-antibody and standard monoclonal antibody against mMAdCAM-1 with Western blot. Conclusion　The spliced mMAdCAM-1 cDNA, expressed protein and multi clonal-antibody can support the further research about the biological activities of mMAdCAM-1.

　　【 Subject words 】　Mouse mucosal addressin cell adhesion molecule-1 (mMAdCAM-1); Protein expression

　　mMAdCAM-1分子（mucosal addressin cell adhesion molecule-1）也称粘膜血管定居因子，是粘附分子免疫球蛋白超家族中的一员。它主要表达于肠道相关淋巴组织和固有层血管内皮细胞上，它同淋巴细胞上的归巢（homing）受体分子整合素α4β7及选择素L-selectin结合，介导淋巴细胞向粘膜部位的定向归巢。另外，该分子还参与某些部位的炎症过程^〔1-3〕。完整的mMAdCAM-1分子由信号肽、胞外区、跨膜区和胞内区四部分组成，胞外区由3个Ig样结构域和一个糖基化的mucin-样区域构成，N-端的两个Ig样结构域与受体α4β7结合时起重要作用，mucin-样区域是与L-selectin发生作用的部位。mMAdCAM-1剪切体是缺失第四个外显子形成的，缺失mucin-样区域和近膜Ig样结构域，不能与L-selectin结合，但仍保持着与整合素α4β7分子结合的特性^〔4〕。mMAdCAM-1分子剪切体变短并丧失了与L-selectin结合的能力，将影响其与淋巴细胞间的结合，目前认为其功能可能在于调节mMAdCAM-1分子与淋巴细胞的相互作用。

　　本文研究获得了mMAdCAM-1分子剪切体cDNA，并将其在原核细胞中进行表达，制备相应抗体，为今后深入研究mMAdCAM-1分子剪切体生物学功能提供便利条件。

　　材料与方法

　　质粒与菌株、动物： 菌株JM109、JM101、DH5α、HB101、XL-1Blue、BL-21为本室保存；质粒pGEX-2T由本室保存。BALB/c小鼠6～8周龄，大耳白兔由本院动物中心提供。

　　主要试剂：pGEM-T载体质粒、质粒提取试剂盒、AMV逆转录酶及Taq DNA聚合酶为Promega公司及上海生工公司产品，T4 DNA连接酶及限制性内切酶等购于华美生物工程公司、天象人生物工程公司等；DNA快速回收纯化试剂盒购于原平生物工程公司；谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析介质购于Pharmacia公司；大鼠抗小鼠MAdCAM-1分子单抗MECA-367，购于Pharmingen公司；生物素标记的羊抗大鼠IgG、羊抗兔IgG及蛋白marker，亲和素标记HRP均由本室制备。

　　引物设计及目的片段的钓取：根据文献报道的mMAdCAM-1核酸序列设计引物^〔5，6〕，两端加有BamHⅠ酶切点，下游引物终止密码子由TGA改为大肠杆菌偏性密码子TAA，能扩增出编码成熟mMAdCAM-1分子剪切体多肽的cDNA序列。上游引物:5′CCGGATCCGGACAGTCCTTCCAGGTG 3′； 下游引物:5′AGGATCCTTATAGGTGTGTACATGAGCT 3′利用异硫氰酸胍一步法^〔7〕从BALB/c小鼠的肠系膜淋巴结（MLN）中提取总RNA，通过RT-PCR反应获得目的基因片段。

　　DNA片段的回收、纯化，质粒的转化、提取和纯化、连接反应：见参考文献〔8〕及相关产品说明书。DNA序列测定由赛百盛公司完成。

　　原核表达载体的构建：将扩增得到的mMAdCAM-1分子剪切体的cDNA片段克隆于pGEM-T中，经DNA测序分析正确后，利用BamHⅠ位点将cDNA片段切下，连入pGEX-2T载体的相应位点，获得重组表达载体pGEX-2T-SM。

　　融合蛋白的诱导表达及纯化：表达菌过夜活化后按1%接种量进行培养，37℃，2～4h；IPTG诱导2～4h。超声破碎菌体，收集上清和沉淀。①亲和层析法纯化：利用亲和层析介质谷胱甘肽-Sepharose 4B进行纯化，方法见说明书。②包涵体初步纯化：菌体沉淀分别用含2% Triton-X-100的2mol/L脲、4mol/L脲洗涤2次后，溶于8mol/L脲中，加入1mmol/L DTT，室温放置1.5h，12000×g离心20min，保存上清。用9倍体积的50mmol/L KH₂PO₄（pH10.7）、1mmol/L EDTA（pH8.0）、50mmol/L NaCl溶液稀释上清，室温放置半小时，并加KOH维持溶液，pH值为10.7。用HCl将溶液的pH值调至8.0，室温放置半小时后，12000×g离心15min，用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）的缓冲液透析上清过夜。测定蛋白浓度，分装后于-20℃保存。

　　凝血酶酶切反应：125mmol/L NaCl、2.5mmol/L CaCl₂、50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中进行酶切反应，融合蛋白与凝血酶的蛋白比例分别为1005，1003，1002，1001，25℃反应2h。

　　mMAdCAM-1剪切体融合蛋白的多抗制备：按常规方法进行，每只家兔融合蛋白的用量为0.2mg蛋白/次。

　　免疫印迹分析：对蛋白进行SDS-PAGE后，按常规方法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，分别用自制抗mMAdCAM-1兔血清 及mMAdCAM-1标准单抗MECA-367反应，生物素标记羊抗兔及羊抗大鼠IgG作为二抗进行检测，亲和素标记的HRP进行DAB显色。

　　结果

　　1. mMAdCAM-1分子剪切体cDNA的获得：利用合成引物对小鼠MLN总RNA进行RT-PCR扩增反应， 扩增产物经凝胶电泳分析表明：扩增片段大小约为0.7kb，与缺失信号肽的mMAdCAM-1分子剪切体cDNA大小相当。

　　2.原核重组表达载体的构建：将RT-PCR获得的扩增片段与载体pGEM-T连接，经核酸序列分析表明与文献报道的mMAdCAM-1分子剪切体cDNA序列完全一致。利用BamHⅠ将cDNA片段从重组质粒pGEM-SM2中切下，与表达载体pGEM-2T连接，经酶切鉴定筛选出正向连接重组表达质粒pGEM-2T-SM。

　　3. mMAdCAM-1剪切体蛋白的表达：分别对含质粒pGEX-2T的载体菌和质粒pGEX-2T-SM的重组菌进行 IPTG诱导表达。结果表明载体菌在相对分子量（M_r)为26×10³处有高表达蛋白，其大小与载体蛋白GST完全一致，是诱导表达的载体蛋白，在上清和沉淀中都存在；而重组菌在M_r约为59×10³处有新的蛋白产生，其大小与推测的mMAdCAM-1剪切体融合蛋白M_r相一致，薄层扫描显示该蛋白占菌体蛋白的44.3%，其主要以包涵体形式存在于沉淀中，上清液中诱导表达的融合蛋白含量很低（见图1）。

　　图1　SDS-PAGE检测诱导表达蛋白

　　Fig 1.SDS-PAGE of induced expression proteins

　　1. Protein markers； 2，3，4. Lysate, supernatant and precitation of vector strain； 5，6，7. Lysate, supernatant and precitation of combinant strain

　　为了增加融合蛋白的可溶性表达，我们分别将pGEX-2T-SM表达质粒转入到JM101、JM109、HB101、DH5α、XL-1Blue及BL-21几个不同大肠杆菌中进行表达，结果发现融合蛋白在这些菌体中都可得到表达，而且表达的量相近，但仍主要以包涵体形式存在；通过改变诱导条件的方式也未能奏效。

　　4.载体蛋白和融合蛋白的纯化：采用亲和层析介质谷胱甘肽-Sepharose 4B对载体蛋白GST及融合蛋白进行纯化，结果表明，纯化的载体蛋白纯度高，达电泳纯，蛋白含量约为0.9mg/ml。而得到的mMAdCAM-1剪切体融合蛋白含量少，并有少许杂蛋白存在。为了获得大量的纯化蛋白，我们对包涵体进行初步纯化，结果表明，获得的融合蛋白纯度可达63.8 %左右，蛋白质含量为0.4～0.5mg/ml（见图2）。

　　图2　纯化蛋白的SDS-PAGE

　　Fig 2. SDS-PAGE of purified protein

　　1. Protein markers； 2. Supernatant of vector strain； 3. Supernatant of vector strain after elution by Glutathione-sepharose-4B； 4. GST protein after elution by Glutathione-sepharose-4B； 5. Purified fusion protein

　　5. mMAdCAM-1剪切体融合蛋白的凝血酶切割实验：融合蛋白与凝血酶作用后可被切成两段，其中一段的M_r约为26×10³，与载体蛋白GST大小相等，另一段M_r约为33×10³，同推测的mMAdCAM-1剪切体蛋白相近，说明为mMAdCAM-1剪切体蛋白。凝血酶切割后在mMAdCAM-1剪切体蛋白的N端留有两个外加的氨基酸Gly和Ser。在本实验条件下，随着凝血酶用量的增加对蛋白的切割越完全（图略）。

　　6. mMAdCAM-1剪切体融合蛋白的免疫学检测： 将亲和层析纯化的mMAdCAM-1剪切体融合蛋白、GST载体蛋白及凝血酶切割后的融合蛋白进行免疫印迹分析实验，结果表明，抗mMAdCAM-1分子的标准单抗MECA-367能够识别融合蛋白及凝血酶切割后融合蛋白中的33×10³蛋白条带，但不识别载体蛋白；多抗不仅识别融合蛋白、载体蛋白同时也能识别33×10³蛋白。由此证明33×10³蛋白即为表达的mMAdCAM-1分子剪切体蛋白。另外，mMAdCAM-1多抗还能识别融合蛋白中的一些杂蛋白（见图3）。

　　图3　融合蛋白的免疫印迹分析

　　Fig 3.Western blot analysis of the fusion protein

　　1. Protein markers； 2,5. Fusion protein； 3,6. Fusion protein digested by thrombin； 4,7. GST protein

　　2-4 react with mutli-antibody, 5-7 react with MECA-367

　　讨论

　　淋巴细胞向淋巴组织和感染部位的定向迁移，是由淋巴细胞表面的粘附分子与表达在组织、器官的血管内皮细胞上的粘附分子相互作用的结果。MAdCAM-1分子特异性表达于肠道相关淋巴组织中，对淋巴细胞向肠道粘膜定向归巢起重要作用。

　　我们利用RT-PCR法从BALB/c小鼠的MLN中获得了mMAdCAM-1分子的剪切体。该剪切体5′和3′端核酸序列与全长mMAdCAM-1分子相同，利用合成引物应能扩增出包括mMAdCAM-1全长分子的两种cDNA，但实验中未见全长分子的cDNA扩增条带出现。 我们认为，虽然两种mMAdCAM-1分子在mRNA含量上相近^〔6〕，但在扩增过程中它们共用一对引物，存在相互竞争。由于mMAdCAM-1剪切体分子短，在扩增初期将略占优势，由于PCR产物是以指数方式积累的，随着反应循环数不断增加，这种优势将不断被扩大，最终使全长mMAdCAM-1分子的扩增反应处于抑制状态，结果仅有mMAdCAM-1分子剪切体cDNA片段被扩增。

　　我们采用pGEX-2T作为原核表达载体，结果发现表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，这同剪切体蛋白分子较大并且含有疏水的跨膜区有关。此时用亲和层析介质纯化上清中的融合蛋白，效果并不好。原因有以下几点： 1. 与上清中存在的可溶性蛋白含量有关。融合蛋白在上清中含量少，与亲和层析介质接触的机会少，因而特异吸附的蛋白含量低；而载体蛋白在上清中含量高，亲和层析蛋白的效果好。 2. 虽然部分融合蛋白以可溶性形式存在，但mMAdCAM-1剪切体蛋白会影响载体蛋白的天然构象，降低其与亲和介质的结合力。我们将处理的可溶性包涵体蛋白进行亲和层析，纯化效果也不理想，这与可溶性包涵体蛋白未能恢复天然构象有关，不能与亲和介质发生特异性吸附。

　　在Western blot中可以观察到，mMAdCAM-1的标准单抗MECA-367能特异识别融合蛋白及凝血酶切割后融合蛋白中的33×10³蛋白条带，对载体蛋白不识别，说明33×10³蛋白为表达的mMAdCAM-1分子；而mMAdCAM-1多抗除识别融合蛋白、mMAdCAM-1分子和载体蛋白外，还与融合蛋白中其它一些蛋白条带起反应，有些位于30×10³附近的蛋白条带，经酶切后消失，它们可能是断裂的融合蛋白。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39789010）

参考文献

　　1，Berg EL, McEvoy LM, Berlin C, et al. L-selectin-mediated lymphocyte rolling on MAdCAM-1, Nature, 1993,366:695-698.

　　2，Briskin MJ, Rott L, Butcher EC, et al. Structural requirements for mucosal vascular addressin binding to its lymphocyte receptor α4β7. J Immunol, 1996, 156: 719-726.

　　3，Yang XD, Michie SA, Mebius QE, et al. The role of cell adhesion molecules in the development of IDDM. Diabetes, 1996, 45:705-710.

　　4，Sampaio SO, Li X, Takeuchi M, et al. Organization, regulatory sequences, and alternatively spliced transcripts of the mucosal addressin cell adhesion molecule-1(MAdCAM-1) gene. J Immunol, 1995, 155: 2477-2486.

　　5，Briskin MJ, McEvoy LM, Butcher EC. MAdCAM-1 has homology to immunoglobulin and mucin-like adhesion receptors and to IgA1. Nature, 1993, 363: 461-464.

　　6，Schiffer SG, Day E, Latanision SM, et al. An alternately spliced mRNA encoding functional domains of murine MAdCAM-1. Biochem Biophy Res Commu, 1995, 216(1): 170-176.

　　7，Piotr C, Nicoletta S. Singal-step method of isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analy Biochem, 1987, 162: 156-159.

　　8，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manul. 2nd, N Y Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989.

(收稿日期：1999-06-02)