耐药质粒pR ST98 在不同种属肠道杆菌间的接合及表达

耐药质粒pR_ST98在不同种属肠道杆菌间的接合及表达

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 细菌学

作者：黄瑞　秦爱兰　闻玉梅

单位：黄瑞 秦爱兰（苏州医学院微生物学教研室）；闻玉梅（上海医科大学）

关键词：耐药质粒；肠道杆菌；接合传递；耐药标志

　　【 摘要 】　目的　研究伤寒杆菌耐药质粒pR_ST98在不同种属肠道杆菌间(大肠杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌及痢疾杆菌)互相接合传递的规律及表达。 方法　 以3株携带不相容性C群（IncC）pR_ST98的伤寒杆菌作供体，用传统及改良的两种接合转移试验方法，研究其在肠道杆菌间的传递及耐药标志的表达，并用核酸内切酶对供体菌及受体接合子的R质粒进行分析。 结果　pR_ST98能在4种肠道杆菌间传递；但在不同种属中R质粒接合难易程度不同；同一R质粒在不同宿主菌中耐药标志的表达亦有差异。 结论　质粒的可传递性给阻断耐药性的传播和疾病的防治带来很大困难，大肠杆菌在一定条件下可将耐药质粒传递给伤寒杆菌等肠道致病菌。正常菌群中庞大的耐药基因库是致病性耐药菌株流行的潜在危险；同一质粒在不同宿主菌中耐药标志的差异显示出耐药质粒表达的多样性和复杂性。

The conjugational transfer and antibiotic resistance expression of S.typhi R plasmid (pR_ST98) in different enteric bacilli

HUANG Rui

　　（Department of Microbiology, Suzhou Medical College, Suzhou 215007,P.R.China）

　　QIN Ailan, WEN Yumei

　　【 Abstract 】　Objective　To study the conjugational transfer and antibiotic resistance expression of pR_ST98 in different enteric bacilli(including E.coli, S.typhi, S.typhimurium and S.flexneri). Methods　The antimicrobial resistance of 13 strains of enteric bacilli were tested against 13 different antimicrobial agents by means of Kirby-Bauer disc agar diffusion. Their plasmid profiles were also determined. In the conjugation test, 3 strains of clinical isolated multiresistant S.typhi harbouring pR_ST98 were tested for the ability to transfer their R plasmids to a plasmid-free laboratory strain of E.coli K₁₂W₁₄₈₅Rif^r. Thereafter, E.coli K₁₂W₁₄₈₅ receiving pR_ST98 were used as dornors, while the sensitive and resistant strains of E.coli, S.typhi, S.typhimurium and S.flexneri as recipients for conjugation. Antibiotic susceptibility, plasmid and restriction enzyme analysis of the donors and transconjugants were used for confirmation of the results. Results　The pR_ST98 could transfer among E.coli, S.typhi, S.typhimurium and S.flexneri, but in different genera the conjugal transfer conditions were different and the resistant markers coded by the same pR_ST98 in different strains varied. Conclusions　pR_ST98 could be transferred from S.typhi to E.coli and then to sensitive and resistant pathogenic bacilli. It is very difficult to block and prevent the spreading of antimicrobial resistance. The varied expression of pR_ST98 in different strains demonstrated the diversity and complexity of the R plasmid.

　　【 Subject words 】　R plasmid; Enteric bacilli; Conjugational transfer; Antibiotic resistance expression

　　80年代末至90年代初，我国由南向北在贵州、湖北、河南、浙江、江苏、安徽等13省市先后发生了多重耐药伤寒的严重流行。我们曾对1987～1992年苏州地区分离的591株伤寒杆菌（S.typhi,ST）进行了耐药监测及研究，质粒电泳证明，其多重耐药性由一相对分子质量为98.6×10⁶(155kb)的大质粒所介导，称之pR_ST98(图1)，而敏感菌株则无质粒检出。经质粒不相容性分群，证实该R质粒属不相容性C群（IncC）^〔1，2〕。1991年起国内伤寒杆菌恢复了对抗生素的敏感性，该质粒亦随之从菌体中消失^〔3〕。然而，伤寒杆菌由于获得新的耐药质粒近几年来在世界上其它国家再次发生流行^〔4，5〕。为研究pR_ST98能否转移至其它肠道菌及这一耐药质粒在不同种属肠道杆菌中的表达，我们选择大肠杆菌(E.coli)、伤寒杆菌、鼠伤寒杆菌(S.typhimurium, STM)及痢疾杆菌(S.flexneri, S.f)进行接合传递和耐药标志表达的研究。

　　材料与方法

　　菌株：接合转移供体菌为临床分离的3株携带IncC群pR_ST98的耐药伤寒杆菌ST_1～3；受体菌(1)：E.coli K₁₂W₁₄₈₅(F^-)Rif^r，该菌不含任何质粒，系经实验室诱变的仅在染色体上有利福平耐药基因的无性菌毛F^-雌性菌；(2)：1株敏感伤寒杆菌ST₄、3株大肠杆菌E.coli_1～3、3株鼠伤寒杆菌STM_1～3及3株福氏痢疾杆菌S.f_1～3。以上菌株除E.coli K₁₂W₁₄₈₅外均从苏州医学院附属一院检验科收集。药敏试验质控菌大肠杆菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿色假单胞菌ATCC27853；含标准相对分子质量质粒菌株E.coliV₅₁₇(35.8,4.8,3.7,3.4,2.6,2.0,1.8,1.4)×10⁶和S.flexneri₂₄₅₇₀(140, 105, 2.6, 2.0)×10⁶及E.coli K₁₂W₁₄₈₅均由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所惠赠。

　　图1　临床分离的伤寒杆菌耐药质粒pR_ST98琼脂糖凝胶电泳图谱

　　Fig 1. Agarose gel electrophoresis of pR_ST98 from clinical isolated multiresistant S.typhi

　　A-F. multiresistant S.typhi

　　G. antibiotic sensitive S.typhi

　　H. S.flexneri₂₄₅₇₀, plasmid size marker〔(140,105,2.6,2.0)×10⁶〕

　　I. E.coli V₅₁₇, plasmid size marker〔(35.8,4.8,3.7,3.4,2.6,2.0,1.8,1.4)×10⁶〕

　　培养基：普通培养基：用于细菌传代与培养。LB培养基：用于细菌活化和质粒接合转移试验中供、受体菌的混合培养。水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton）培养基：用于药敏试验。中国蓝和SS琼脂培养基：加入利福平等相应抗生素，用于接合转移试验的选择性培养基。

　　药物与试剂：除利福平外（由苏州第三制药厂提供），氯霉素、卡那霉素、氨苄西林、四环素和诺氟沙星均为标准品，购自中国药品生物制品检定所。抗生素药敏纸片：除利福平外（大连生化试剂厂），均系上海医化所产品。

　　药敏试验：采用Kirby-Bauer纸片扩散法，结果判断根据NCCLS1999。选用13种药物：利福平(Rif)，氯霉素(Cm)，复方磺胺(Cos)，链霉素(Sm)，庆大霉素(Gm)，卡那霉素(Km)、阿米卡星(Akn)，头孢噻吩(Cp)，新霉素(Nm)，四环素(Tc)，氨苄西林(Ap)，羧苄西林(Cb)，诺氟沙星(Nf)。试验时用质控菌与待测菌平行测定结果，实行质量控制。

　　质粒的接合转移试验：方法一：伤寒杆菌pR_ST98向E.coli K₁₂W₁₄₈₅的接合转移主要按文献〔6〕进行。方法二：接受了pR_ST98的E.coli K₁₂W₁₄₈₅作供体，向其它敏感及耐药的肠道菌接合时，按文献〔7〕改良进行。供、受体菌分别接种于4ml LB肉汤，37℃过夜。各吸0.1ml加入4ml LB肉汤，37℃，4h混合后4000r/min离心5min，弃上清，菌体用1ml生理盐水混匀，吸取0.1ml涂布于水解酪蛋白琼脂37℃过夜。用2ml生理盐水洗下菌苔，经10^-2～10^-3稀释后，吸取0.1ml菌液均匀涂布于含药的SS琼脂。抗生素剂量分别为Rif(100μg/ml)、Cm(20μg/ml)、Km(25μg/ml)、Tc(25μg/ml)、Ap(25μg/ml)和Nf(25μg/ml)。取无色透明菌落在相同选择琼脂上传代1次，再于普通琼脂上活化后，进行药敏试验并做质粒电泳检测和核酸内切酶分析。

　　质粒提取及质粒电泳检测：按Takahashi法^〔8〕进行。

　　结果

　　1.药敏试验及质粒DNA检测：13株肠道杆菌耐药谱见表1。3株多重耐药伤寒杆菌ST_1～3均含1个98.6×10⁶质粒，其余耐药菌株都携带1～3个质粒（图2）。敏感伤寒杆菌ST₄、大肠杆菌E.coli₃、鼠伤寒杆菌STM₃及痢疾杆菌S.f₃不含质粒。

　　图2　接合传递试验部分供、受体菌的质粒图谱

　　Fig 2. Plasmid profile of partial donors and recipients

　　A. ST₁; B. ST₂; C. ST₃; D. E.coli₁; E. E.coli₂; F. STM₁; G. STM₂; H. Sf₁; I. Sf₂　　2.pR_ST98由伤寒杆菌向大肠杆菌的接合传递：以Rif和Cm作为选择抗生素，E.coli K₁₂W₁₄₈₅作受体菌进行接合转移试验。结果3株伤寒杆菌pR_ST98均能转移至受体菌，pR_ST98还能直接从伤寒杆菌传递至临床分离的大肠杆菌。接合传递时，在液体培养基中混合培养3h后R质粒即发生传递。但该质粒在37℃和26℃条件下接合转移频率明显不同，37℃时为1.3×10^-4，而26℃时为3.0×10^-2，提示温度较低时，其转移频率高。

表1　13株受试菌及ST₁ pR_ST98向其它肠道杆菌传递后接合子的耐药谱

　　Table 1. The antibiograms of 13 tested strains and their conjugants after receiving of ST₁ pR_ST98

Strains

Antimicrobial agents

Rif

Cm

Cos

Sm

Gm

Km

Akn

Cp

Nm

Tc

Ap

Cb

Nf

Dornors

S.typhi

ST1

S*

R**

R

R

R

S

S

R

R

S

R

R

S

Rif+Cm***

ST2

S

R

R

R

S

R

S

R

R

R

R

R

S

Rif+Cm

ST3

S

R

R

S

R

R

S

R

R

R

R

R

S

Rif+Cm

Recipients

E.coliK12W1485

R

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

Rif+Cm

ST4

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

Cm+Ap

E.coli1

S

S

S

S

S

S

S

R

R

R

R

R

R

Cm+Nf

E.coli2

S

S

R

S

S

S

R

S

R

□

R

R

R

Cm+Nf

E.coli3

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

Cm+Ap

S.typhimurium

STM1

S

S

S

R

S

□

S

S

R

S

R

R

R

Cm+Nf

STM2

S

S

S

R

R

R

S

R

R

S

R

R

S

Cm+Km

STM3

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

Cm+Ap

S.flexneri

S.f1

S

R

R

S

R

S

S

S

R

R

S

S

S

Tc+Ap

S.f2

S

S

R

S

S

R

S

S

S

S

R

R

S

Cm+Km

S.f3

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

Cm+Ap

　　*：Original sensitive markers of each strain; after the recipients received of ST₁pR_ST98(conjugants) they became resistant to the corresponding antibiotics except those with under lines

　　**：Original resistant markers of each strain

　　***：Antimicrobial agents used for conjugational transfer selection

　　-：The under lines represent the resistant markers unable to be transferred from the donors to the recipients

　　□：New resistant markers which did not exist both in the donors and the recipients appeared in conjugants　　3.接受了pR_ST98的大肠杆菌向其它细菌的接合传递：将加入相应抗生素的SS平板作选择培养基，以接受了ST_1～3 pR_ST98的E.coli K₁₂W₁₄₈₅(ST_1～3/E.coli K₁₂W₁₄₈₅)作供体，耐药及敏感的大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、痢疾杆菌和敏感的伤寒杆菌作受体进行接合转移试验。结果接受了pR_ST98的E.coli K₁₂W₁₄₈₅可将其质粒传递给其它敏感及耐药的肠道致病菌。以大肠杆菌作供体，与受体菌混合培养3h，并无接合子选出，需经过夜培养、离心，使供受体菌密切接触、且需在固体琼脂表面接合才能筛选到很少量的接合子。

　　4.pR_ST98在不同肠道杆菌宿主菌内的表达：质粒DNA电泳检测接合子内均含一个与供体菌相对分子质量相同的质粒带（图3）。药敏试验表明，受体接合子中有的未能全部表达供体质粒的耐药标志，有的却出现了供体菌没有的新的耐药标志。如ST_1～3 pR_ST98向E.coli K₁₂W₁₄₈₅转移后，Sm和Gm耐药标志未表达；pR_ST98向野生型E.coli_1～3传递时，上述两种耐药标志亦未能同步出现；向STM传递时，除Sm、Gm及Cp外，Cos也未表达；当pR_ST98向S.f和敏感的ST₄传递时，Sm、Gm及Cp均不能传递。值得提出的是，在ST₁pR_ST98/E.coli₂和ST₁/E.coli K₁₂/STM₁接合子中，还分别出现了供、受体菌都没有的新的耐药标志——Tc和Km(见表1)。

　　讨论

　　细菌耐药的机理十分复杂，其中由R质粒通过接合、转导和转化在微生物间传播介导的耐药是目前研究的重点之一^〔9，10〕。肠道杆菌以人和动物肠腔作为其共同生存的环境，彼此密切接触，从而为R质粒在体内传递提供了良好的条件。为研究正常肠道菌是否能作为耐药质粒的储存库或中介站，本研究用两种接合转移试验方法对pR_ST98在肠道杆菌间进行传递研究。结果表明，伤寒杆菌非常容易将其R质粒传递给作为正常菌群的大肠杆菌；接受了耐药质粒的大肠杆菌又可作为媒介将耐药基因传递给其它肠道菌。说明质粒的可传递性给耐药性传播的阻断和疾病的防治带来了很大困难，单纯消除某个细菌中的耐药质粒已难以奏效，正常菌群中庞大的耐药基因库是致病性耐药菌株流行的潜在危险。

　　图3　接合传递试验部分接合子的质粒图谱

　　Fig 3. Plasmid profile of partly tested conjugants

　　A. E.coli V₅₁₇; B. ST₁/E.coli K₁₂W₁₄₈₅; C. ST₁/E.coli K₁₂/E.coli₂; D. ST₁/E.coli K₁₂/E.coli₁; E. ST₁/E.coli K₁₂/E.coli₃; F. ST₁/E.coli K₁₂/ST₄; G. ST₁/E.coli K₁₂/STM₃; H. ST₁/E.coli K₁₂/S.f₁; I. ST₁/E.coli K₁₂/S.f₃; J. ST₁/E.coli K₁₂/S.f₂

　　Mazodier等^〔11〕曾报道，在大肠杆菌中发现的仅耐Km的转座子Tn₅在导入根瘤菌时则表现出对Sm也耐药。我们的实验结果发现，同一耐药质粒在不同宿主菌中表达的耐药标志有差异。在pR_ST98向其它肠道杆菌接合传递时，质粒电泳检测及内切酶图谱未发现转移前后有所改变，但所有的Sm耐药标志均未表达。根据我们对伤寒杆菌耐药性的持续监测，1986年前及1990年后大多数菌株均单耐Sm，并未检测到R质粒^〔3〕，因此可能pR_ST98并不编码Sm耐药基因。另外，在接合传递过程中，Gm和Cp等不表达频率也较高。更有意义的是，在接合子中还出现了供、受体菌均没有的新的耐药标志。推测此种现象可能与耐药基因表达的调控有关，宿主菌内环境及染色体对耐药基因表达起着重要作用，细菌间的基因传递可使某些“沉默基因”得以表达。因此，对细菌耐药性的基础性研究不应只局限于研究质粒基因，还应包括质粒与受体菌的相互作用，即研究质粒DNA与宿主细胞间的相互作用。

　　基金项目：江苏省卫生厅基金资助项目(基金编号：H9507)

　　黄瑞：上海医科大学在职博士生

参考文献

　　1，黄瑞，穆荣普.多重耐药伤寒沙门氏菌耐药质粒的研究.中华传染病杂志,1990,8(3)：139-142.

　　2，顾国浩,穆荣普.伤寒杆菌R质粒不相容性分群.中华微生物学和免疫学杂志,1992,12(6):357-360.

　　3，黄瑞,穆荣普.伤寒沙门氏菌耐药性及其耐药质粒的监测.中华传染病杂志,1994,12(4):202- 206.

　　4，Panigrahi D,Aneziz AH，West PM. Plasmid-mediated multidrug resistance in Salmonella typhi in Kuwait. Trop Med Int Health,1996,1(4):439-442.

　　5，Hasan Z,Rahmen KM，Alam MN. Role of a large plasmid in mediation of multiple drug resistance in Salmonella typhi and paratyphi A in Bangladesh. Bangladesh Med Res Counc Bull,1995,21(1):50-54.

　　6，包幼迪.细菌的结合转移试验.福建医学院学报增刊，1984，100-102.

　　7，Roe DE,Weinberg A,Roberts MC. Mobile rRNA methylase genes coding for erythromycin resistance in Actinobacillus actinomycetemcomitans. J Antimicrobial Chemotherapy,1996,37:457-464.

　　8，Takahashi S,Nagano Y. Rapid procedure for isolation of plasmid DNA and application to epidemiology analysis. J Clin Microbiol,1984,20(4):608-613.

　　9，Conner CP,Heithoff DM，Hahan MJ. In vivo gene expression:Contributions to infection,virulence,and pathogenesis. Current Top Microbiol Immun, 1998,225:1-12.

　　10，Miller RV. Bacterial gene swapping in nature. Scientific American,1998,278(1):66-71.

　　11，Mazodier P,Giraud E,Gasseer F. Genetic analysis of the streptomycin resistance encoded by Tn₅. Molecular and General Genetics,1983,192:155-162.

(收稿日期：1999-07-10)