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抗HBs人VH基因中异常序列对抗体活性影响的研究
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第4期第20卷 基因工程抗体
作者：陈晓穗 朱迎春 王欲晓 王琰 顾维丰
单位：陈晓穗 朱迎春 王欲晓 王琰（海军总医院）；顾维丰（北京医科大学基础医学院免疫系）
关键词：抗体可变区；HBsAg；分子结构
【 摘要 】 目的 从噬菌体抗体库中克隆到1株VH第3骨架区中含有异常序列的抗HBs人Fab基因，探讨该VH基因中异常序列对抗体活性的影响。 方法 采用重叠PCR方法去除了这段异常序列，构建表达载体，转化大肠杆菌表达出抗HBsAg噬菌体抗体和可溶性Fab，测定了它们与抗原的结合活性。 结果 与原抗体比较，改造后的抗体与抗原的结合活性明显下降，分子模建提示这段异常序列对VH CDR1和CDR2的部分氨基酸残基的位置有一些影响，测定改造前Fab的亲和力约为0.55×109mol/L，改造后Fab因抗原结合活性过低，无法检测其亲和力。 结论 提示这段异常序列在体内可能存在于该VH之中。
A stretch of extra-sequence in an anti-HBs VH gene is indispensable for the antibody activity
CHEN Xiaohui, ZHU Yingchun, WANG Yuxiao
（Navy General Hospital, Beijing 100037, P. R. China）
【 Abstract 】 Objective Previously we cloned a human anti-HBs Fab, the VH of which contained a stretch of extra-sequence. In this work we investigated the effect of the extra-sequence on the activity of the anti-HBs Fab. Methods Following removal of the extra-sequence by overlap PCR, the modified Fab gene was expressed in E.coli, and its Ag binding activity tested and compared with the original Fab. Results The modified Fab showed drastically decreased Ag binding activity. Molecular modeling demonstrated changes in some residues in VH CDR1 and CDR2. The associate constant of the original Fab is about 0.55×109mol/L, while the ELISA signal of the modified Fab was too weak to determine the affinity. Conclusion The VH containing extra-sequence may exist in vivo.
【 Subject words 】 Antibody variable region; HBsAg; Molecular structure
抗体分子的轻重链由可变区和恒定区等数个结构域组成，可变区与恒定区氨基酸残基数均非常保守，是抗体功能活性的重要基础。我们曾经从乙肝表面抗原疫苗免疫的志愿者获取淋巴细胞构建了人源性噬菌体抗体库，并从中克隆到1株抗HBsAg人Fab基因，其VH在第三骨架区内77～78位氨基酸之间发现7个多出的氨基酸，经对基因数据库检索未能查到其来源〔1〕。由于免疫球蛋白可变区骨架区的氨基酸序列长度及组成均极为保守，也未见此类现象的报道，因此我们设想这段序列很可能是在抗体库构建及筛选过程中所插入。考虑到此特异性抗体基因来自经抗原免疫的人体，抗原的结合能力在体内形成后插入的片段有可能影响其与抗原结合的亲和力。因此我们通过基因改造除去这段序列，改善该抗体与抗原的结合性能。结果发现与我们预期相反，此段序列去除后抗体活性明显下降，现将实验结果报告如下。
材料与方法
质粒、菌株及主要实验材料：含有抗HBsAg人Fab基因的噬菌体抗体表达载体p3HB2和可溶性Fab表达载体p3HB2S(去掉基因Ⅲ的p3HB2)，由本实验室构建〔1〕。大肠杆菌菌株XL1-Blue及辅助病毒VCSM13购自美国Stratagene公司。
引物：去除抗HBsAg人Fab的VH中异常序列的引物HB2-1为5′-ACATCCAGGAGCACAGCCTACATGG
AATTG，此引物前16个碱基与异常序列上游的序列互补，后14个碱基与异常序列下游的碱基互补。HB2-2为5′-CAATTCCATGTAGGCTGTGCTCCTGGATGT，
此引物前14个碱基与异常序列下游的序列互补，后16个碱基与异常序列上游的序列互补，是 HB2-1互补序列。重链Fd段5′端引物为5′-CAGTCCATATGAAATAACTATTGCCTAC，3′端引物为GCATGTACTAG
TTTTGTCACAAGA，下划线处为SpeI识别位点。VH 5′端引物为SAGGTGCAGCTCGAGSAGTCTGGG，3′端引物为GCCCTTGGTACTAGTTGARGAGACRGTGACC。
主要试剂：提取质粒DNA的Wizard Plus Minipreps DNA Purification System，PCR所用的dNTP等试剂，各种分子生物学试验用的工具酶，以及细菌培养用的试剂等，购自美国Promega公司。羊抗人Fab和HRP-羊抗人IgG购自美国Sigma公司；HRP-羊抗人Fab购自美国Pierce公司；HRP-羊抗M13噬菌体购自瑞典Pharmacia公司。重组HBsAg由卫生部长春生物制品研究所惠赠。
PCR去除VH中的异常序列（见图1）：以质粒为模板，分别以重链Fd段5′端引物和HB2-2为引物扩增出VH中异常序列上游的部分，用HB2-1和重链Fd段3′端引物扩增出异常序列下游的序列，经琼脂糖电泳及电洗脱回收后，通过重叠PCR，以所获的2个片段互为模板与引物，先扩增7个循环，再加入扩增Fd的5′和3′端的引物，继续扩增30个循环。电泳分离±0.7kb的条带，电洗脱回收，将其重组到p3HB2中替换未经改造的Fd基因，得到噬菌体抗体表达载体p3HB2M噬菌体抗体的制备及滴度测定：挑取含有噬菌体抗体表达载体的XL1-Blue菌单集落，接种于LB液中(含Amp、葡萄糖)，37℃ 培养过夜。次日取30μl加入SB(含Amp)1.5ml，37℃培养至A600=0.3～0.4，加入辅助病毒VCSM13 30μl，28℃培养过夜。离心收集上清，即为噬菌体抗体。
图1 PCR法对VH改造示意图
Fig 1. Schematic diagram for the modification of VH gene with PCR
稀释噬菌体抗体(10-7、10-8、10-9、10-10)，分别与新鲜培养的XL1-Blue菌液混合，37℃ 15min，铺Amp-LB平板，37℃培养过夜，次日以菌落数计算噬菌体Ab的滴度(CFU)。
噬菌体抗体结合活性的测定：用包被液稀释HBsAg至0.9μg/ml，包被ELISA板，4℃ 过夜，用1%BSA-PBS封闭后，加入稀释成相同滴度的噬菌体抗体培养上清，37℃ 1h；洗5次，加HRP-羊抗M13，37℃ 1h；同上洗涤后以OPD显色。测定A490值。
可溶性Fab载体的构建及表达：用NheⅠ酶切质粒p3HB2M，以除去外壳蛋白Ⅲ基因，自身连接后，得到可溶性表达载体p3HB2MS。将含有可溶性Fab表达载体的XL1-Blue菌接种于SB液(含Amp)，37℃培养A600=0.5，加入IPTG至1mmol/L，28℃诱导过夜。离心收集上清，即为可溶性Fab。
可溶性Fab的定量和结合活性的测定
Fab定量：用羊抗人Fab包被ELISA板，1% BSA-PBS封闭后，加入可溶性Fab培养上清和不同稀释度的人IgG标准品，37℃ 1h，洗涤3次，加入HRP-羊抗人Fab，37℃ 1h，同上洗涤后加入OPD显色，测定A490值。
Fab段活性检测：用HBsAg 0.9μg/ml包被ELISA板，1% BSA封闭后加入稀释至同一浓度的可溶性Fab，其余步骤同上。
抗HBsAg Fab的亲和力测定：采用非竞争性酶免疫法〔2〕测定亲和力，分别用每毫升含有2.6μg、1.3μg、0.65μg和0.325μg的HBsAg包被ELISA板，将可溶性Fab从15mmol/L起倍比稀释后加样，以HRP-羊抗人Fab和OPD进行显色反应，测定A490值。按公式：K=n-1÷n(Ab′-［Ab］)计算亲和常数，其中［Ab′］为当HBsAg包被浓度为［Ag′］时得到的A50(即最大值的50%)时的抗体浓度；［Ab］为：当HBsAg包被浓度为［Ag］时得到的A50时的抗体浓度。n则等于［Ag］÷［Ag′］。
VH的同源模建：使用工作软件InsightⅡ（MSI/BIOSYM）的Homology模块，通过Databases 菜单下Run_Fasta命令找到同源参照蛋白，用Alignment菜单下Structure及Multiple_Sequence 命令分别完成结构和序列排列，并参照结构排列结果对序列排列参数进行修正，使结构保守区在序列上尽量保守。然后通过坐标转移得到目的蛋白在结构保守区处的坐标，再通过Loops菜单搜索，生成非保守区的坐标。最后使用Discover模块进行分子力学优化和分子动力学模拟。
结果
1.VH基因中异常序列的去除：根据VH中异常序列上游和下游的序列，设计了2个引物，分别PCR先扩增出异常序列上下游2个片段，再利用2个片段末端的互补，用Overlap PCR法扩增去除了异常序列的Fd段(图1)，将其重组到p3HB2载体中形成表达载体p3HB2M，经内切酶分析证实后，进一步测定DNA序列证实21个碱基的异常序列已除去，其余序列与p3HB2相同。如图2所示。
图2 去除异常序列前后的VH序列比较
Fig 2. Sequence alignment of the VH before and after modification Underlined sequences are CDRs
改造前后VH的立体构象分析：通过分子模建，我们构建了改造前后的VH的立体构象，如图3所示，异常序列形成了一个襻状结构，并未组成到CDR区域中，但对CDR1和CDR2某些残基的位置有所影响。
图3 改造前后的VH三维立体结构图
Fig 3. Stereodrawing of the α-carbon trace of VH with(A) or without(B) the extra sequence
CDRs are shown as thicker lines, the solid arrow denotes the extra sequence
通过对二者的迭加，发现CDR1的30～34位和CDR2的62～66位Cα有位移，表1所示为改造前后Cα的相对距离，可见第32位及64位相对位置变化较大。
表1 VH改造前后某些位置Cα的相对距离
Table 1. Relative distance of some Cα before and after modification of the VH
| Cα | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 |
| Distance(Å) | 0.74 | 1.65 | 1.56 | 0.93 | 0.70 | 0.70 | 1.25 | 1.80 | 0.54 | 0.78 |
3.改造前后Fab段的抗原结合活性的比较
(1)分别制备改造前后的2种噬菌体抗体(每种各选3个克隆)，将滴度调至108 CFU/ml后进行抗原结合活性测定，结果发现改造后的噬菌体抗体活性明显降低(表2)。
表2 噬菌体抗体与HBsAg结合的ELISA测定(A490)
Table 2. Binding of phage antibodies to HBsAg
| Clone 1 | Clone 2 | Clone 3 | |
| HB2 | 1.70±0.02 | 1.72±0.077 | 1.70±0.04 |
| HB2M | 0.37±0.02 | 0.63±0.03 | 0.54±0.02 |
HB2: Before VH modification；HB2M: After VH modification
Helper phage was used as control with A490 of 0.154±0.02
(2)为进一步核实以上结果，构建了可溶性Fab表达载体p3HB2S和p3HB2MS，制备了可溶性Fab。将2种可溶性Fab（每种3个克隆）经测定浓度后稀释至相同含量（0.8μg/ml）后进行抗原结合活性测定，结果发现去除了异常序列的可溶性Fab的活性仍明显降低(表3)。
表3 可溶性Fab与HBsAg结合的ELISA测定(A490)
Table 3. Binding of soluble Fab to HBsAg
| Clone 1 | Clone 2 | Clone 3 | |
| HB2 | 2.30±0.02 | 2.09±0.01 | 1.98±0.04 |
| HB2M | 0.31±0.02 | 0.37±0.02 | 0.28±0.04 |
HB2: Before VH modification；HB2M: After VH modification
Anti-TNFα Fab was used as control with A490 of 0.025±0.01 4.改造前后VH转换为完整人IgG在真核表达后的活性比较：因原核表达的Fab是在细菌质周腔中进行折叠，与真核细胞中的折叠环境有所不同，为除外此因素的作用，我们又将改造前后的可变区基因构建成完整人IgG1表达载体，在CHO细胞进行表达（另文发表）。将两种抗体稀释至相同浓度（20ng/ml），测定与HBsAg的结合活性，结果仍然是不含异常序列的IgG与抗原结合活性明显低于改造前的IgG（表4）。
表4 抗HBsAg人IgG与HBsAg结合的ELISA测定（A490）
Table 4. Binding of human IgG to HBsAg
| CHO sup. | Anti-HBs Ig | HB2 | HB2M |
| 0.02±0.01 | 1.748±0.01 | 1.62±0.01 | 0.20±0.02 |
HB2：Before VH modification；HB2M：After VH modification；Anti-HBs Ig：Another clone of anti-HBs human Ig used as positive control
5.抗HBsAg Fab的亲和力测定：采用Beatty等报道的非竞争性酶免疫法测定了改造前的可溶性Fab的亲和常数，约为0.55×109mol/L(图4)。改造后的Fab段ELISA读数过低，无法进行亲和力的测定。
图4 抗HBsAg Fab在不同浓度抗原包被时的ELISA曲线
Fig 4. ELISA curves of anti-HBs at different Ag coating concentration
Dash lines denotes A50 points of each curve
讨论
抗体分子的一级结构和立体结构非常保守〔3〕，迄今未见在功能性抗体分子中多出这么多异常氨基酸残基的报道。因此，我们最初考虑这段序列在体内已经存在的可能性不大，很可能是抗体库构建筛选过程中重组的结果。此Fab段有较高的亲和力（0.55×109mol/L），应是体内免疫过程中亲和力成熟后所形成，异常序列位于第三骨架区的中间，经立体构象分析对Fv的结构有一定影响，可能会影响抗体的亲和力。因此，我们设想除去这段序列，恢复其在体内的初始结构，有可能提高其抗原结合性能。本工作采用Overlap PCR方法成功地去除了这段序列，表达了噬菌体抗体和可溶性Fab，并与原抗体的抗原结合活性进行了比较。结果出乎我们预料，发现去除了异常序列的噬菌体抗体和可溶性Fab的抗原结合活性明显下降。考虑到这是在原核系统进行表达，Fab段的折叠和二聚体形成是在大肠杆菌质周腔完成，与哺乳类细胞有一定差别〔4〕。我们又将改造前后的可变区基因构建成完整人IgG1分子，在CHO细胞进行表达。结果仍然是异常序列去除后抗原结合活性明显降低。对于这个意外结果可能有两种解释：（1）该VH段在体内时没有该段异常序列，也不具备与HBsAg以高亲和力结合的能力，在体外重组过程中插入了异常序列，该段序列对VH立体结构造成变化，与适当的κ链配对后形成了高亲和力的抗体。这提示高亲和力是在体外形成的。但通常抗体可变区的突变绝大部分造成亲和力下降〔5〕，极少数可改善亲和力的变种在体内经正负选择得以扩增。因此，在体外这种偶然的突变造成亲和力大幅度提高的可能性不大。（2）该VH在体内已存在这段异常序列，由于抗体可变区基因在个体发生过程中要经历极为复杂的重组（VDJ重排）和突变（亲和力成熟），因此很难推测这段异常序列是存在于胚系VH基因中或是产生于重组或突变过程。由于除去这段序列后抗原结合活性极低，体内亲和力成熟时的体细胞突变又以点突变为主，因此这段序列在亲和力成熟过程中产生的可能性不大。有可能在初次反应中生成的抗HBs抗体中已存在这一序列。尽管已经发表的可变区序列中未见到类似情况，这一序列的来源也不明，但本实验结果却提示这种可能性的存在。
基金项目：国家科委863基金资助项目（Z18-01-02-03）
参考文献
1，王琰, 刘群英, 化冰,等. 从人源性噬菌体抗体库分离出1株含有异常序列的抗HBsAg Fab克隆. 中国免疫学杂志, 1998, 14(2):115-118.
2，Beatty JD. Baetty BG, Vlahos WG. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J Immunol Methods, 1987, 100:173-179.
3，Padlan EA. Anatomy of the antibody molecule. Mole Immunol, 1994, 31:169-217.
4，Verma R, Boleti E, George AJT. Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J Immunol Methods, 1998, 216:165-181.
5，Chen C, Roberts VA, Rittenberg MB. Generation and analysis of random point mutations in an antibody CDR2 sequence: many mutated antibodies lose their ability to bind antigen. J Exp Med, 1992, 176:855-866.
(收稿日期：1999-07-24)