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铜绿假单胞菌外毒素A的抗原性及其与辅助细胞的关系
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 细菌学
作者：梁小兵 庄汉澜 周洁 詹轶群 郭庆福
单位：100850 北京，军事医学科学院微生物流行病研究所
关键词：铜绿假单胞菌外毒素A；抗原；淋巴细胞增殖；辅助细胞；CTLL细胞株
【 摘要 】 目的 研究铜绿假单胞菌外毒素A（PE)的某些抗原性及其与辅助细胞的关系。 方法 用MTT法观察PE在有无辅助细胞参与条件下对鼠脾淋巴细胞的刺激作用,并用鼠细胞毒性T细胞株CTLL进行证实。 结果 PE在0.01～100ng/ml浓度范围能刺激鼠脾淋巴细胞增殖，PE的丝裂原作用无需粘附细胞的辅助，但粘附细胞及其粘附细胞的PE刺激上清能协同PE对鼠脾淋巴细胞的刺激作用。PE在丝裂原作用范围内能刺激CTLL细胞生长，并与IL-2有协同作用。PE在体内能使小鼠脾淋巴细胞自发淋转率增高，对ConA刺激的增殖反应增强，但对淋巴细胞自发分泌IL-2和ConA诱导IL-2的产生水平无影响。 结论 PE在无辅助细胞参与条件下也能刺激淋巴细胞增殖。
Superantigen of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and its relationship with accessory cells
LIANG Xiao-bing, ZHUANG Hanlan, ZHOU Jie, et al.
（Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100850, P. R. China）
【 Abstract 】 Objective Study on superantigen Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (PE) and its relationship with accessory cell (AC). Methods PE-induced proliferation of murine splenocyte with or without accessory cells, cytotoxicity of murine cytolytic T cell line CTLL. Results PE was found to be able to stimulate the proliferation of murine splenocyte in the absence of accessory cells. Accessory cell and its supernatant from AC stimulated with PE was able to enhance the proliferation of lymphocyte induced by PE. Meanwhile, PE also stimulated proliferation of murine CTL cell line CTLL and enhanced IL-2 effectiveness in CTLL proliferation. Antibody to PE could block this function. In vivo PE could enhance murine splenocyte proliferation but not level of IL-2 production. Conclusion PE is a unique superantigen that stimulates murine splenocyte proliferation in the absence of acces-sory cells.
【 Subject words 】 Pseudomonas aeruginosa exotoxin A; Superantigen; Accessory cell; CTLL
铜绿假单胞菌外毒素A（PE)为条件致病菌铜绿假单胞菌分泌的一种相对分子质量(Mr)为66×103的单链多肽，可分为三个结构功能区：Ⅰ区系氨基末端区，与靶细胞上2-巨球蛋白受体结合；Ⅱ区为跨膜区，与毒素“越膜就位”有关；Ⅲ区是羧基末端区，具有ADPR转移酶活性，为毒素分子的活性部分，通过抑制蛋白质的合成而导致细胞死亡〔1〕。在亚致死剂量，PE具有其它微生物抗原的性质〔2-4〕，如：PE能诱导鼠胸腺细胞转化，其刺激作用需要辅助细胞的处理及提呈等。我们在研究PE对鼠脾淋巴细胞的抗原作用时，发现PE在无辅助细胞参与的情况下也能刺激淋巴细胞增殖，现报告如下：
材料与方法
动物和细胞株：纯系BALB/c雄性小鼠，8～12周龄，购自本院动物中心，IL-2依赖株CTLL，引自本院六所；小鼠成纤维细胞L929，引自本所二室。
培养基和试剂：PE(Cal Biochemical Corporation Lot 072291)；ConA(Sigma)；MTT(Fluka)；RPMI 1640(GIBCO)；抗PE多克隆抗体(本室制备)。
淋巴细胞转化试验：断颈处死小鼠，无菌取脾，制备脾细胞悬液(8×106/ml)，取细胞悬液、PE、ConA等样品各100μl，加入96孔板，37℃，5%CO2培养箱孵育不同时间，用MTT法检测，每组设3个复孔。
脾细胞悬液中粘附细胞的去除：调整BALB/c 小鼠脾细胞浓度为4×106/ml，置大空斑瓶(底面积5×8cm2)中培养2h，使粘附细胞贴壁，收集未贴壁细胞，即为脾非粘附细胞，通过姬姆萨染色观察，粘附细胞的去除率在95%以上。
小鼠腹腔巨噬细胞（MΦ）的制备：将3ml培养液注入小鼠腹腔，轻揉腹部，吸出腹腔液体，用培养液洗涤细胞2次配成2×106/ml，加到24孔平底培养板，1ml/孔，置37℃，CO2孵箱培养2h，弃去未粘附细胞，粘附细胞即为小鼠腹腔巨噬细胞。
CTLL细胞增殖试验：CTLL细胞株用含20%小牛血清、IL-2 200U/ml的RPMI 1640完全培养基传代培养，将处于对数生长期的CTLL细胞用不含IL-2的完全培养基洗涤2次，取细胞悬液(106/ml)及PE等样品各100μl，加入96孔培养板中，置37℃，5%CO2及饱和湿度下培养24～48h，用MTT法测定。设标准IL-2和完全培养基对照。
PE免疫小鼠：按本室常规进行。亚致死剂量PE腹腔注射3次，间隔7～10d。
结果
1.PE的抗原性：用台盼蓝染料排除法计算不同浓度PE与脾细胞共同孵育不同时间细胞存活率，结果显示：PE浓度大于或等于100ng/ml，表现出毒性作用，所以我们将PE的刺激剂量定在100ng/ml以内。
PE的丝裂原作用：PE在0～100ng/ml范围设6个浓度组，与鼠脾细胞共同培育1、2、4、7d，测定淋转值，结果表明：PE的淋转刺激浓度在0.01～10ng/ml之间，最适浓度为0.01～1.0ng/ml。PE组培育24h，未观察到淋转现象，随培养时间延长，吸光度A值逐渐升高，第4天A值最高。ConA刺激组24h即有淋转现象，最高刺激指数在第2天就能观察到。PE的淋转刺激指数为ConA的1/2，刺激时间相对延长，可见，PE为弱丝裂原(图1)。
图1 PE刺激鼠脾细胞淋转的动力学曲线
Fig 1. Kinetics of murine splenocyte proliferation as a response to PE stimulation
PE协同ConA对鼠脾细胞致有丝分裂作用：将ConA固定在2.5μg/ml，分别加入不同浓度的PE，与鼠脾细胞37℃孵育3～4d，作淋转测定。结果显示：PE在丝裂原作用最适浓度范围对ConA的淋转刺激有协同作用（图2)。
图2 PE对ConA诱导淋转的协同作用
Fig 2. PE enhances ConA-induced proliferation
PE的丝裂原作用与粘附细胞的关系：文献报道，PE诱导胸腺细胞淋转需要辅助细胞〔3〕。我们试验了PE刺激脾细胞淋转与粘附细胞的关系，结果发现(图3)：PE诱导去除粘附细胞后的脾细胞淋转虽不如去除粘附细胞以前高，但仍能刺激淋转，加入腹腔巨噬细胞（MΦ）后，刺激值又恢复到以前的水平。
图3 PE诱导的淋转与粘附细胞的关系
Fig 3. Relation of PE-induced proliferation with accessory cells
为了弄清是粘附细胞还是其产生的细胞因子协同PE诱导淋转，我们将PE与小鼠腹腔MΦ共培育24h，取培育上清，加入脾非粘附细胞培育4d，结果表明(图3)：PE与MΦ的培育上清能诱导脾非粘附细胞转化。刺激值大于PE单独刺激的值。虽然PE与粘附细胞共育上清中残留一定量的PE，但淋转刺激值较单独PE刺激的值要高，则上清中存在某种细胞因子参与PE的刺激作用。
2.PE免疫小鼠脾细胞免疫功能的测定：为了了解PE在体内对细胞免疫的影响，我们用PE免疫小鼠3次后，无菌取脾制成细胞悬液，观察在有或无ConA刺激下，脾淋巴细胞增殖反应和IL-2产生水平。表1显示：PE免疫小鼠脾淋巴细胞自发淋转A值高于正常小鼠对照组，而IL-2分泌水平两组差异无显著性。PE免疫小鼠脾细胞对ConA的增殖反应较正常小鼠对照组明显增强，而对ConA诱导IL-2产生水平与对照组差异无显著性。结果表明：PE的丝裂原作用可促进小鼠脾细胞增殖，对脾细胞分泌IL-2能力无影响。
表1 PE在体内对鼠脾淋巴细胞转化及IL-2分泌水平的影响
Table 1. Effect of PE on splenocyte proliferation and IL-2 level in vivo
| Groups | Splenocyte | Splenocyte stimulated by ConA | ||
| Proliferation | IL-2 level | Proliferation | IL-2 level | |
| Control |
0.07±0.01 |
0.20±0.01 |
0.30±0.02 |
0.79±0.02 |
| PE | 0.21±0.01* | 0.23±0.02 | 0.62±0.03* | 0.80±0.02 |
Note:*P＜0.01 vs control 3.PE对CTLL细胞的作用：为了验证PE的抗原作用在无辅助细胞参与的情况下也能进行，我们用鼠细胞毒性T细胞株CTLL进行了证实。
PE刺激CTLL细胞生长：以不同浓度PE与洗涤后的CTLL细胞共孵育24～48h，用MTT法观察CTLL细胞生长情况时发现(图4)：PE能刺激IL-2依赖株CTLL细胞生长，最佳刺激剂量范围与淋转相同，即0.01～1ng/ml，可见PE在无辅助细胞的参入下也能刺激淋巴细胞增殖。
PE协同IL-2刺激CTLL细胞生长：将IL-2浓度固定在50U/ml，加入不同浓度PE，与CTLL细胞共孵育24～48h，发现PE在较大范围(0.001～10ng/ml)内对IL-2的刺激有协同作用，最佳刺激剂量为0.01～1.0ng/ml(图4)。
我们采用2种方法使PE失活：①PE与抗PE血清37℃作用60min。②PE经70℃加热处理30min。2种方法处理后，PE对细胞L929的毒性消失(传代细胞L929是文献报道对PE最敏感的细胞，能作为指示细胞判断PE的毒力)，处理后的PE对CTLL细胞的刺激作用消失，说明CTLL细胞的增殖由PE引起(图4)。
图4 PE对CTLL细胞的作用
Fig 4. Effect of PE on the CTLL cells
讨论
铜绿假单胞菌外毒素A具有双向免疫调节作用，可诱导鼠胸腺细胞增殖分化〔4〕，PE对鼠胸腺细胞的抗原作用需要辅助细胞的处理和提呈〔2〕，为了了解PE对细胞免疫的影响，我们观察了PE在体内外对鼠脾淋巴细胞的作用。鉴于PE对许多哺乳动物细胞有毒性，所以在实验前，首先用台盼蓝试验确定了PE对鼠脾细胞的毒性剂量范围。结果显示：当PE剂量大于或等于100ng/ml时，对脾细胞显示明显毒性作用。以亚致死剂量PE与脾细胞共孵育时发现：PE对脾细胞有丝裂原作用，最佳刺激剂量为0.01～1ng/ml，刺激高峰时间为4d。与ConA相比，其所需剂量比ConA低1000倍，但刺激时间较长，淋转刺激值比ConA低1倍以上。所以PE是弱丝裂原。我们在实验中得出的PE最适剂量范围较国外报道〔5〕的剂量低100倍，可能是产品来源不同、纯度不同或其它原因。进一步观察PE的丝裂原作用与粘附细胞的关系时发现：在没有粘附细胞参入下，PE也能刺激淋巴细胞增殖，不象国外报道〔3〕的那样需要粘附细胞的辅助。但国外报道的是PE刺激胸腺细胞淋转需要粘附细胞辅助，可能胸腺细胞与脾细胞的表面受体和分子有所不同或其转化机制不同所致。此外，我们发现：分别加入鼠腹腔巨噬细胞、PE刺激腹腔巨噬细胞培养上清能提高PE对脾非粘附细胞的转化作用，这与国外报道PE刺激的粘附细胞上清能取代粘附细胞导致胸腺细胞淋转的结果有相似之处〔4〕。这些结果说明：上清中存在的某种细胞因子可刺激淋巴细胞转化，而不是由辅助细胞处理PE再呈递给淋巴细胞而使后者转化。推测PE对脾细胞丝裂原作用的可能机制是：PE对脾细胞中的淋巴细胞和粘附细胞均有作用，脾淋巴细胞直接受毒素结构上某表位的刺激而导致转化，粘附细胞则吞噬、处理PE，释放出PE片段或(和)某种细胞因子，再进一步促进淋巴细胞转化，在PE对脾淋巴细胞转化中，粘附细胞（吞噬细胞）起到协同、辅助的作用。
为了探讨PE淋转的直接诱发机理，我们将PE与鼠细胞毒性T细胞株CTLL（IL-2依赖株）共孵育24～48h，发现PE在0.01～1ng/ml剂量范围能刺激CTLL细胞生长，并与IL-2有协同作用。CTLL细胞为传代细胞，不含有粘附细胞，PE能使CTLL细胞增殖，必然也能直接作用于脾细胞而无需依赖粘附细胞的辅助。PE加热70℃处理和抗PE血清中和后失去对CTLL细胞的刺激作用，PE究竟与细胞上哪部分结合，通过何种途径刺激淋巴细胞增殖将是我们今后要研究的课题。国内外目前还未见此方面的研究报道。
我们观察到：PE在体内能增强脾细胞的自发转化，但对脾细胞的IL-2分泌无影响，与国外报道PE在体外不能诱导脾细胞IL-2分泌的结果相似〔6〕。实验中观察到：PE免疫的鼠脾细胞对ConA的反应增强，同时发现PE在体外与ConA也有协同作用，而国外报道PE在体外抑制PHA诱导的人外周血淋巴细胞转化作用，两者实验结果相反，有可能是人与鼠的免疫应答不同，或ConA与PHA丝裂原作用机理、方式不同之故。
目前，对铜绿假单胞菌感染的防治是世界上迫切期望解决的问题，弄清PE的作用机制，包括PE对机体免疫功能的影响，将有助于人类最终攻克这一疾病。
参考文献
1，Allured YS, Collier R, Carrol SF, et al. Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0-ngstrom resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83:1320-1324.
2，Legaard PK, Legrand RD, Misfeldt ML. Lymphoproliferative activity of Pseudomonas exotoxin A is dependent on intracellular processing and is associated with the carboxyl-terminal portion. Infect Immun, 1992, 60(4)：1273-1278.
3，Legaard PK, Legrand RD, Misfeldt ML. The superantigen Pseudomonas exotoxin A requires additional functions from accessory cells for T lymphocyte proliferation. Cell Immunol, 1991, 135:372-382.
4，Misfeldt ML, Legaard PK, Howell SE, et al.Induction of interleukin-1 from murine peritoneal macrophages by Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infect Immun, 1990, 58(4):978-982.
5，White JA, Herman AM, Pullen RK, et al. The Vβ-specific superantigen Staphylococcal entertoxin B: Stimulation of mature T cell and clonal deletion in neonatal mice. Cell, 1989, 56:27-35.
6，Willner TZ. Induction of murine cytolytic T lymphocytes by Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infect Immun, 1988, 56:213-218.
(收稿日期：1999-07-16)