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反义寡核苷酸对HCV 5′NCR基因调控功能的特异性抑制作用
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 抗感染免疫
作者：王小红 王升启 朱宝珍
单位：100850 北京，军事医学科学院放射医学研究所
HCV 5′NCR在所有病毒分离株中是最保守的区域，由341个核苷酸(nt)构成，形成复杂的二、三级结构，包括4个茎环结构、远距离的碱基对(125～133nt与315～323nt序列)相互作用形成的螺旋结构及翻译起始区附近的假结结构，这些结构均是内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)的重要成分，对HCV基因的翻译与复制可能具有重要作用〔1〕。我们采用HCV 5′NCR调控荧光素酶基因的瞬间表达系统〔2〕，对互补于HCV 5′NCR及翻译起始区的S-ASODNs进行抗HCV活性筛选及评价，探讨S-ASODNs的最佳作用靶序列。
材料与方法
S-ASODN的设计和合成：根据从中国患者血清中克隆及序列分析获得的HCV 5′NCR全长序列，部分C基因序列(25个氨基酸)，参考其计算机预测的二级结构，采用计算机辅助设计了15条S-ASODNs、3条正义寡核苷酸及1条随机序列。所有寡核苷酸均采用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成，并在合成时进行硫代修饰。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15?h后，经Micro PureⅡ反相纯化柱(Solid Phase Sciences)纯化，紫外(Beckman DU640)定量后真空(Oligo Prep OP120, SAVANT)干燥，-20℃保存备用。
细胞培养 ：HepG2肝癌细胞由军事医学科学院微生物与流行病研究所王海涛研究员惠赠。采用DMEM培养基(含10％小牛血清、青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)在37℃，5％CO2条件下进行培养及传代。
质粒转染 ：pHCV-neo4为含HCV 5′NCR调控荧光素酶基因的表达载体。HepG2肝癌细胞接种于96孔板(NUNC)，104细胞/孔，37℃，5％CO2孵育18～20?h，(80～90)％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体lipofectin(GIBCO, 1mg/ml)试剂并参照说明书进行转染。每孔细胞用质粒0.1μg，脂质体1μg，总体积100μl。转染时，在消毒的1.5ml离心管中，质粒0.1μg与脂质体1μg分别用无血清DMEM培养基12.5μl稀释，室温放置30?min后，将脂质体与质粒溶液混匀，室温下再置30?min，以便形成脂质体-质粒复合物，然后加入无血清DMEM培养基75μl。培养细胞用无血清DMEM培养基洗2次，每孔细胞加入总体积100μl的质粒-脂质体复合物溶液，作用5?h，换含10％小牛血清的DMEM生长培养基，继续培养24?h后，检测荧光素酶活性。
细胞密度无论高或低，pHCV-neo4荧光素酶表达水平均较低，仅当细胞接种18～20?h，90％汇合时进行转染，可获得较高水平的表达。质粒用量不同，其荧光素酶表达水平不同，而表达水平的高低明显影响ASODN的作用效果。因此，本研究均采用在同一批实验中，相同实验条件下获得的实验结果进行比较分析。
S-ASODN活性评价：将S-ASODN分别与质粒共转染HepG2肝癌细胞，方法同上。以不加S-ASODN的质粒转染为阳性对照。每次实验中，每一S-ASODN均设3孔，结果取其平均值。
荧光素酶活性检测：荧光素酶活性检测采用荧光素酶测定试剂盒并参考其推荐的操作步骤进行。待测细胞用PBS(pH7.3)洗2次，每孔细胞加1×细胞裂解液20μl，室温下裂解10?min，加荧光素酶作用底物50μl，混匀，立即在多标记检测仪(VICTORTM Wallac1420 MULTILABEL COUNTER)上测1?s发光强度，输出值为CPS。
结果分析：采用Statistica统计软件进行线性回归分析计算IC50值。
结果与讨论
1.S-ASODN抑制HCV调控基因的有效靶序列及剂量依赖性：从表1可见，12条S-ASODN中，有6条，即HCV65、HCV88、HCV279、HCV313、HCV363及HCV349对HCV调控基因的抑制活性超过50％，浓度在25～100nmol/L范围内时，具有明显的剂量依赖性。另外6条S-ASODN未见明显的抑制活性，且无剂量依赖性关系，其中4条S-ASODN可见促进荧光素酶表达的作用。ASODN的GC含量与其活性之间无明显关系。结果提示HCV RNA 5′NCR第二茎环结构、第三茎环结构及翻译起始区序列可能是ASODN作用的重要靶序列。综合文献资料，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型HCV分离株的第三茎环结构与翻译起始区均是ASODN作用的重要靶序列〔3〕。结合本研究结果，提示互补于HCV RNA 5′NCR第三茎环结构与翻译起始区序列的ASODN对HCV不同分离株可能具有交叉抑制能力。此外，值得注意的是在本研究中首次发现HCV65(互补于第二茎环结构)具有较强的抑制活性，与HCV363及HCV349的作用强度相当，值得进一步研究。
表1 12条S-ASODN对HCV调控基因的抑制活性
| 名称 | 二级结构 | GC含量(％) | 抑制率(%) | IC50值(nmol/L) | ||
| 25nmol/L | 50nmol/L | 100nmol/L | ||||
| HCV41 | 单链 | 50 |
3.9 |
17.0 |
-4.1 |
＞100 |
| HCV65 | 茎环结构Ⅱa | 50 | 25.3 | 53.2 | 88.8 | 44.7 |
| HCV88 | 茎环结构Ⅱb | 60 | 24.0 | 34.6 | 50.2 | ＞100 |
| HCV123 | 茎环结构Ⅱc | 75 | -16.4 | 10.6 | -48.3 | ＞100 |
| HCV173 | 茎环结构Ⅲa | 60 | 32.2 | 39.1 | 28.1 | ＞100 |
| HCV217 | 茎环结构Ⅲb | 55 | 3.9 | 9.8 | 28.2 | ＞100 |
| HCV243 | 茎环结构Ⅲc | 70 | -29 | 6.6 | 30.7 | ＞100 |
| HCV279 | 茎环结构Ⅲd | 65 | 14.1 | 50.3 | 81.9 | 50.2 |
| HCV313 | 假结结构 | 65 | 7.1 | 28.5 | 63.2 | 74.7 |
| HCV363 | 茎环结构Ⅳ | 55 | 39.1 | 57.0 | 82.8 | 36.3 |
| HCV349 | 茎环结构Ⅳ | 70 | 25.4 | 62.0 | 87.8 | 41.6 |
| HCV373 | 单链 | 35 | -17.9 | 5.7 | -8.0 | ＞100 |
2.S-ASODN抑制HCV调控基因的序列特异性：为了论证ASODN作用的特异性，实验中设计一些正义寡核苷酸、无关序列ASODN及不含HCV基因序列的靶载体进行了阴性对照实验(见图1)。在25～100nmol/L浓度范围内，除HCV279s外，正义寡核苷酸HCV363s、HCV349s及无关序列NS对HCV调控基因的抑制率均在20％以下，仅HCV279s的抑制率达51.1％。另一方面，HCV279、HCV363及HCV349对不含HCV序列的pGL3报告载体的荧光素酶活性抑制率最高分别为40.2％、43.3％及48.4％。这些寡核苷酸的作用均无剂量依赖性关系。结果表明，在该浓度范围内，ASODN特异性抑制HCV调控基因的表达，仅存在轻度非特异性作用。Alt等人在实验中也观察到类似的现象，如抑制HCV基因翻译最有效的ASODN(ODN4)对不含HCV序列的荧光素酶基因表达活性的抑制率达51％，这可能与ASODN的硫代修饰有关。
图1 ASODN对HCV调控基因抑制的序列特异性
文献报道S-ASODN对HCV基因表达的抑制具有翻译捕获及RNase H活性诱导两种机理的参与。RNase H是一种特异性降解DNA∶RNA杂交体中RNA成分的酶，而HCV是一种单链正义RNA病毒，因此，RNase H介导的HCV基因表达的抑制作用是双重的，即病毒的翻译及复制均受到抑制。HCV可能是反义寡核苷酸作用的理想靶标。本研究初步论证了ASODN对HCV的抑制活性，并获得了几条有明显抑制活性的HCV特异性ASODN，为进一步对ASODN抗HCV研究奠定了良好的基础。
基金项目：国家“863”资助项目(102-08-04-01)；国家自然科学基金资助项目(39500179)；军队“9．5”重点课题(96Z007)；
参考文献
1，Major ME, Feinstone S. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology, 1997, 25(6):1527-1538.
2，王小红，王升启，李梦东，等. HCV 5′NCR片段调控荧光素酶表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达. 中华微生物学和免疫学杂志, 1999, 19(1):17-20.
3，Wakita T, Wands JR. Specific inhibition of hepatitis C virus expression by antisense oligodeoxynucleotides. J Biol Chem, 1994, 269(19):14205-14210.
(收稿日期：1999-03-29)