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丙型肝炎病毒体外感染原代人胎肝细胞的研究
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 抗感染免疫
作者：宋志强 郝飞 王英杰 刘国栋
单位：宋志强 郝飞（第三军医大学西南医院皮肤科）；王英杰 刘国栋（全军传染病专科中心）
关键词：丙型肝炎病毒；人胎肝细胞；细胞培养；细胞模型
【 摘要 】 目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）体外细胞培养方法。方法 原代人胎肝细胞与HCV感染血清共孵育后，用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化分别检测细胞和培养上清中的HCV rNA和HCV抗原表达。 结果 从感染血清和细胞共同孵育后的2～25d，细胞内和/或培养上清中可间断检出HCV正、负链RNA；HCV nS3抗原在细胞内能稳定表达；原位杂交显示HCV 负链RNA阳性物质多位于细胞浆。结论 原代人胎肝细胞对HCV易感，可用作HCV体外感染和复制的靶细胞。
Study on in vitro infection of human fetal hepatocytes by hepatitis C virus
SONG Zhiqiang, hAO Fei, WANG Yingjie, et al.
（Department of Dermatology, Southwest Hospi）
【 Abstract 】 Objective Cultivation of hepatitis C virus in vitro. Methods Human fetal hepatocytes were incubated with serum from a hepatitis C patient. After incubation, the presence of HCV rNA, the expression of HCV NS3 antigens in cells and/or supernatant were detected by RT-PCR, in situ hybridization and immunohistochemistry respectively. results It was found that plus-and minus-strand of HCV RNA could be detected in cells and/or supernatant during a period of 25 days post-inoculation. HCV NS3 antigens were expressed within cytoplasm of infected cells. HCV RNA was located within cytoplasm. Conclusion Human fetal hepatocytes were susceptible to HCV and could be used as target cell for the infection and replication of HCV in vitro.
【 Subject words 】 Hepatitis C virus; Human fetal hepatocytes; Cell model
丙型肝炎病毒（HCV）分子生物学方面的研究已有很大进步，但其感染的机制、复制的方式等尚未完全明确，这主要是因为迄今一直缺乏适宜HCV感染和复制的细胞和动物模型。原代人胎肝细胞（Human fetal hepatocytes，HFHs）由于易于分离和培养，已经广泛用于肝炎病毒体外培养〔1〕。我们用慢性丙型肝炎病毒患者的血清感染体外培养的HFH，初步证实HCV在细胞内的复制可达25天。现报告如下。
材料和方法
实验标本：实验所用的感染材料来自重庆地区一慢性丙型肝炎患者的血清，经RT-PCR法检测证实为阳性。正常血清来自我院输血科健康献血员。细胞培养所用的小牛血清由本校试剂中心提供。血清无菌采集后分装并冻存于-20℃。所有血清使用前均经56℃30 min灭活补体。
主要试剂
完全培养基：以1640培养基(GIBCO)为基础，加入下列主要成分，终浓度分别为：地塞米松、胰岛素、胰高血糖素均为10-9mol/L，L-谷氨酸300mg/L，卡那霉素30mg/L和小牛血清10%。
免疫组化试剂：链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法（SP法）免疫组化试剂盒及3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；HCV nS3单克隆抗体由北京医科大学肝病研究所提供〔2〕。
RT-PCR检测HCV正、负链RNA试剂盒：由北京医科大学肝病研究所提供〔3〕。
Dig标记的HCV正链寡核苷酸探针：参照Bukh等〔4〕的HCV5′非编码区探针序列，即(-95～-56nt) 5′-CTGCTAGCCGACTAGTGTTGGGTCCGCGAAACCGCTTG
tGG-3′，由本科王小红博士后惠赠，由军事医学科学院二所制备和纯化。碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体（抗Dig-AP，工作浓度1∶500）、封闭试剂和NBT/BCIP溶液为德国宝灵曼公司产品。
原代胎肝细胞培养：采用体外简易两步灌流法〔5〕分离胎肝细胞后，用完全培养基将细胞稀释至2×106/ml，接种5ml的培养板和已加盖玻片的12孔培养板，置37℃含5%的CO2培养箱，每2～3d部分更换培养基。
HCV体外感染胎肝细胞：同时设立感染组和对照组。
感染组：取细胞生长良好的培养瓶/板，移去培养基，加入适量的HCV感染血清（5ml的培养瓶中加0.4ml；12孔培养板每孔加0.1ml），然后加入适量的完全培养基(5ml培养瓶、12孔培养板中的终体积分别为2ml、0.5ml)，轻轻摇匀，置入培养箱37℃8h后，弃上清，以1640充分洗涤6～8次，并留取最后一次洗液以待检，然后再加入2ml完全培养基继续培养。
对照组：取细胞生长良好的培养瓶/板，移去培养基，加入与感染血清等量的正常人血清(正常对照，血清最终浓度为10％)或等量的生理盐水（空白对照）。
标本收集
培养上清：吸取1ml培养上清置经二乙基焦碳酸酯(DEPC)水处理并高温灭菌的Eppendorf管中，1000×g离心5min后取上清并移入另一管中（以除掉细胞碎片），置入-20℃冰箱冻存，备RT-PCR检测HCV正、负链RNA。
细胞收集：弃去培养上清后，以1640洗涤6次后，用0.25%胰蛋白酶消化部分细胞制成细胞悬液，以50×g离心5min，弃上清，重悬于PBS滤浮后再离心，如此反复6次（以排除来自培养上清的干扰）；将细胞沉淀与少量二甲基亚砜混合后于-20℃冰箱冻存，备RT-PCR检测HCV正、负链RNA。
细胞爬片：用镊子从培养板中取出细胞爬片，立即用0.01mol/L的PBS漂洗3次，每次30s。然后用4%多聚甲醛固定15min，再用PBS漂洗3次，置于-20℃保存，备免疫组化检测细胞内的HCV抗原表达或用原位杂交对细胞内的HCV rNA进行定位。
细胞及培养上清中HCV正、负链RNA的检测：采用RT-PCR方法，试剂盒由北京医科大学肝炎试剂研制中心提供〔5〕，操作按说明书进行，其简要步骤：提取 hCV RNA，加入逆转录试验反应体系(检测正链RNA时选择负链引物,检测负链RNA时选择正链引物)，37℃60min，95℃ 5min；在逆转录产物中加入PCR反应缓冲液(含聚合酶及HCV正链或负链外引物)94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 2min，60个循环后，72℃继续反应10min，取扩增产物10μl与1μl载样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的2%琼脂糖，于1×TAE缓冲液中，在5V/cm的电压下电泳30min。在紫外灯下观察145bp处有荧光带者即为阳性。
免疫组化(SP法)检测细胞内的HCV抗原：取制备好的细胞爬片，PBS漂洗3次，每次5min（下同）；用0.03% h2O2-甲醇溶液37℃孵育10min；PBS漂洗，移入含0.02% tween-20的PBS中2min；20%的正常羊血清37℃孵育10min后，吸去多余的液体，加入HCV nS3单克隆抗体，4℃冰箱中孵育12～24min；PBS漂洗，加生物素标记的第二抗体，37℃孵育30min；PBS中漂洗，加入SP液，37℃孵育30min；PBS漂洗；DAB显色3～5 min，PBS漂洗终止显色，苏木素衬染，透明，封片，显微镜下观察，照相。对照实验：分别用1%小牛血清白蛋白（第一抗体稀释液）、PBS替代第一抗体作第一抗体替代对照；用PBS分别替代生物素标记的第二抗体和SP液作试剂替代对照。
原位杂交：参照文献〔5〕。细胞爬片在PBS中漂洗1min，25mg/L的蛋白酶K消化30min，4%的多聚甲醛室温下固定10min，PBS漂洗1min，2×SSC溶液漂洗15min，50%、75%、90%、100%的乙醇序列脱水各1min，自然风干；将含有探针的杂交液（85℃，1ng/μl）滴加在细胞爬片上，每片约20～40μl，用封口膜覆盖，放入湿盒内（先用50%甲酰胺浸湿的纸餐巾垫好），37℃下杂交16h；50℃2×SSC溶液轻轻洗掉封口膜，42℃ 2×SSC溶液漂洗20min，37℃ 1×SSC溶液漂洗15min，37℃0.1×SSC溶液中漂洗10min，1号Dig缓冲液室温下5min，含1.5%的1号Dig缓冲液37℃下60min，加入1∶500稀释的Dig抗体，37℃下孵育30min，1号Dig缓冲液漂洗5min，2号Dig缓冲液漂洗3min，NBT/BCIP显色，显微镜下观察确认充分显色后，PBS漂洗终止显色，50%、75%、90%、100%的乙醇系列脱水，透明，中性树胶封片，照相。替代对照：分别用不加探针的杂交液和不加抗Dig抗体的1号Dig缓冲液作对照。
结果
1.培养上清中HCV正、负链RNA的检出：阳性片段位于145bp处。培养上清中HCV正链RNA在感染后第5～27天可间断地检出；培养上清中未检测出负链RNA（见表1及图1～3）。正常对照组、空白对照组及最后1次洗液均为阴性。
2.细胞内HCV RNA的检出：细胞内HCV正、负链RNA的首次检出时间是在感染后第3天，以后一直到第25天细胞内HCV rNA均可间断地检出（见表1）。
表1 原代人胎肝细胞内和培养上清中HCV rNA的检测
Table 1．Detection of HCV RNA in human fetal hepatocytes and supernatant by RT-PCR
| After infection
days |
Cells | Supernatant | ||
| RNA(P) | RNA(M) | RNA(P) | RNA(M) | |
| 1 | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | ++ | + | - | - |
| 5 | + | + | + | - |
| 8 | ++ | ++ | - | - |
| 12 | ++ | ++ | ++ | - |
| 15 | + | + | - | - |
| 18 | ++ | - | + | - |
| 20 | ++ | ++ | ++ | - |
| 23 | - | + | - | - |
| 25 | + | - | - | - |
| 27 | - | - | + | - |
| 30 | - | - | - | - |
Note: +： weakly positive； ++： positive；-： negative； P： plus-strand； M： minus-strand
图1 RT-PCR检测胎肝细胞内HCV正链RNA
Fig 1．Detection of plus-strand of HCV RNA in fetal hepatocytes
图2 RT-PCR检测胎肝细胞内HCV负链RNA
Fig 2．Detection of minus-strand of HCV RNA in fetal hepatocytes
图3 RT-PCR检测胎肝培养上清中HCV正链RNA
Fig 3．Detection of plus-strand of HCV RNA in supernatant
3.免疫组化结果：收集细胞爬片后，用SP法检测细胞内HCV nS3抗原的表达，可见阳性细胞多呈点状和散在分布，弥漫性分布少见；阳性物质呈细小棕黄色颗粒，多呈胞浆均质型，少数呈胞浆不均质型；少数细胞核内亦可见阳性表达。光镜下阳性细胞未见形态的明显变化。正常对照组、空白对照组及免疫组化的对照实验均未见阳性细胞出现。
4.原位杂交：细胞接种感染血清后第4、8、25天的细胞爬片中，可见蓝色着色的杂交阳性细胞，阳性细胞呈散在分布/点状分布，阳性物质呈蓝紫色细小颗粒，其表现形式以胞浆型为多见。Dig-HCV cDNA探针原位杂交特异性确证实验：分别用不加探针的杂交液替代Dig-HCV cDNA探针后，未见杂交阳性细胞；不加Dig抗体的1号Dig缓冲液亦为阴性。
讨论
为了深入研究HCV感染细胞的机制和筛选HCV蛋白含中和抗原表位区段，必须建立理想的感染模型。由于黑猩猩的数量有限，价格昂贵，不可能在研究中普遍应用；以HCV基因转染所建立的细胞模型无法用于HCV感染、入侵靶细胞方式和机理的研究。用自然存在于病人血液中的HCV直接感染培养细胞，可建立接近自然感染状态的细胞模型，适宜于HCV感染靶细胞的方式、复制机理以及中和抗体/疫苗的研究。
近年来国内外学者的研究表明，多种细胞在体外均可感染HCV，并建立了部分能稳定复制的细胞模型〔6-9〕。这些细胞模型的建立极大开拓了人们研究HCV的策略和途径的选择，尤其是对HCV在人T淋巴细胞系的长期复制，极大地丰富了人们有关HCV分子生物学方面的知识。然而，肝细胞是HCV在体内的自然靶细胞，病毒感染非肝细胞的方式和途径是否类似体内感染肝细胞尚无从考证。人T淋巴细胞的HCV感染模型用于预防性疫苗的筛选尚有待进一步探讨。
我们用HCV感染血清体外直接感染人胎肝细胞后，在细胞内和/或培养上清中检出了HCV的正、负链RNA，并且发现感染细胞内HCV抗原亦有较好的表达。我们认为，培养上清及细胞中检测到的HCV rNA是新复制出的，而不是感染血清残留的。根据有：①感染血清中未检测到HCV负链RNA；②我们在实验中发现，感染血清在37℃孵箱中放置3d后再用RT-PCR检测时其结果由阳性转为阴性，说明HCV rNA在体外不能长时间存在；③细胞接种感染血清8h后经6次洗涤留取的最后1次洗液，经RT-PCR检测证实HCV rNA为阴性；④在接种后培养第1～3天细胞内未检测到负链RNA，而此后负链RNA信号却可间断地检出；⑤原位杂交和RT-PCR均证实胞内存在HCV复制中间体（负链RNA）；⑥免疫组化证实细胞内有HCV nS3抗原表达。
因为细胞爬片能更好地保持培养细胞的形态和结构，所以我们在实验中用细胞爬片对细胞内HCV抗原的表达和HCV rNA的定位作了观察，结果与人体内肝组织的对应检测结果相似〔10,11〕，提示HCV在体外人胎肝细胞中的复制、表达可能和体内接近。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（39670672）
参考文献
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(收稿日期：1999-06-21)