汉坦病毒Z10株M片段全基因序列分析

汉坦病毒Z10株M片段全基因序列分析

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 疫苗学

作者：姚智慧　董关木　俞永新　刘文雪　朱智勇

单位：姚智慧 董关木 俞永新 刘文雪(中国药品生物制品检定所)；朱智勇(浙江省卫生防疫站)

关键词：汉坦病毒；Z10株；M片段；序列分析

　　【 摘要 】　目的　测定我国疫苗株Z10的M片段全基因序列，了解其分子基础，并分析其与其它汉坦病毒株的遗传学差异。方法　从Z10株病毒感染的细胞提取总RNA，将逆转录PCR扩增的产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定，应用DNASTAR软件分析比较。结果　 Z10株M片段的全基因序列共3 615个核苷酸，四种核苷酸的比例分别为A 30.15%，T 29.41%，G 21.72%，C 18.73%。以第二种读码方式推导出其最大读码框架从41到3 448，共编码1 135个氨基酸。序列同源分析表明，Z10株与HTN型核苷酸同源性为83.6%～87.4%，与SEO，DOB和Thai型为69.5%～70.8%，而与PUU和HPS各型病毒同源性仅为57.6%～59.9%。氨基酸同源分析Z10株与HTN型同源性高达94.2%～96.0%，与SEO，DOB和Thai型为73.3%～76.6%，而与PUU和HPS各型病毒同源仅为53.2%～56.3%。绘出了核苷酸和氨基酸的系统发生树。结论　Z10株为不同于已报告M片段全基因序列的HTN型国内外毒株的另一亚型，并具有16个独特的氨基酸。

Complete sequence analysis of the M genome segment of Hantavirus Z10 strain

YAO Zhihui, DONG Guanmu, YU Yongxin, et al.

　　(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China)

　　【 Abstract 】　Objective　To Sequence the complete sequence of the M genome of Hantavirus Z10 strain which has been exploited for inactivated vaccine production in China, to explore its molecular characteristics and compare it with other Hantaviruses.Methods　The total RNA were prepared from Z10 virus infected cells and the RT-PCR product was cloned into T vector, sequenced and analyzed using DNASTAR software.Results　The Z10 complete M segment was 3615 nucleotides in length with a single open reading frame extending from 41 to 3448 encoding 1135 amino acids. It showed 83.6%-87.4% homology with other 7 HTN viruses at the nucleotide level and 94.2%-96% at the amino acid level, only 69.5%-70.8% homologous with SEO, DOB & Thai viruses at the nucleotide level and 73.3%-76.6% at the amino acid level, while just 57.6%-59.9% homologous with PUU, HPS viruses at the nucleotide level and 53.2%-56.3% at the amino acid level. We got the phylogenetic tree depending on the nucleotide and amino acid sequences.Conclusion　The results suggest that Z10 strain is a new subtype with 16 unique amino acids different from other HTN viruses

　　【 Subject words 】　Hantavirus; Z10 strain; M gene; Sequence analysis

　　Z10株分离自病人血^〔1〕，应用国际标准的空斑减少中和试验方法对其抗原性和血清学型别分析表明，Z10株为汉滩（HTN）型病毒，对同型病毒有很好的交叉中和作用，对异型病毒也有一定的交叉中和反应^〔2,3〕。用Z10株制备的沙鼠肾细胞灭活疫苗，实验室方法和动物均对同型病毒有良好的免疫保护作用，经人体观察已批准正式生产作为商品苗使用^〔4-6〕。为了解Z10株的分子基础，我们克隆了M片段的全基因，并对其进行了序列分析。

　　材料和方法

　　细胞和毒株：Vero细胞来自美国ATCC。Z10毒株分离自浙江省肾综合征出血热病人血，由浙江省卫生防疫站朱智勇教授提供，本实验室以Vero细胞传代增殖，-70℃保存。

　　引物的设计与合成：参考已知的汉滩病毒标准株76-118株M片段的核苷酸序列和文献〔7，8〕，设计并由GIBCO BRL公司合成一条引物，5′-TAGTAGTAGACTCCGCAA-3′（1～18），用于逆转录和PCR。

　　病毒RNA的提取，逆转录PCR和克隆：病毒以0.01感染复数感染Vero细胞后37℃培养10 d左右，病毒滴度近10⁷ PFU/ml，用GIBCO BRL公司的Trizol总RNA提取试剂盒，按说明书的方法提取感染病毒的细胞总RNA，溶于无RNA酶的水中，用引物和Promega公司的逆转录酶合成第一链cDNA，然后分别用Takara的EX Taq和LA Taq进行35个循环的PCR，最后延伸10 min。将PCR产物纯化后克隆于Takara公司的T载体，转化DH5α宿主菌，用蓝白斑法进行筛选鉴定。

　　DNA序列测定和分析：克隆产物经酶切和PCR鉴定，柱纯化后，用T7和M13公用引物和Perkin Elmer(PE)公司的BigDye^TM测序试剂盒反应后，在ABI PRISM^TM 377 DNA测序仪进行序列测定。测定的结果应用DNASTAR软件进行分析，并同GeneBank所报告的28株汉坦病毒（Hantavirus）M片段全基因序列进行比较分析(表1)。

表1　本研究所引用的毒株来源

　　Table 1. Hantavirus isolates used in this study

Virus	Type	Source	No. of GeneBank
76-118	HTN	Korea	M14627
Z10		China	AF143675
A9		China	AF035831
C1-1		Japan	D25529
C1-2		Japan	D25532
Hojo		Korea	D00367
HV114		China	L08753
Lee		Korea	D00377
HB55	SEO	China	AF035832
L99		China	AF035833
R22		China	S68035
8039		Korea	S47716
SR-11		Japan	M34882
Cg1820	PUU	Russia	M29979
K27		Russia	L08754
P360		Russia	L08755
Sotkam		Europe	X61034
Dobrava	DOB	Yugoslavia	L33685
Thai749	THA	Thailand	L08756
Moravia	TUL	Europe	Z69993
Bayou	HPS	USA	L36930
Blueriver		USA	AF030551
Bluriver-Ok		USA	AF030552
ELMC		USA	U26828
Hu39694		Argentina	AF028023
Laguna		USA	AF005728
NewYork-1		USA	U36802
NM10		USA	L25783
NM11		USA	L37903

　　结果

　　1.PCR扩增和产物的克隆：分别用Takara的EX Taq和LA Taq经35个循环的一次性PCR均得到了与理论值相符合的约3.6kb的产物，经纯化的产物克隆于T载体，应用酶切证实为正确的克隆。

　　2.Z10毒株M片段的全基因序列及其编码的氨基酸：序列测定表明Z10株M片段的全基因序列共3 615个核苷酸，见图1。四种核苷酸的比例分别为A 30.15%，T 29.41%，G 21.72%，C 18.73%，GC含量为40.44%，AT含量为59.56%。Z10株M片段全基因序列以第二种读码方式推导出其最大读码框架从41到3 448，共编码1 135个氨基酸，见图2。相对分子质量为126.3×10³，等电点为7.13。Z10毒株M片段的全基因及其推导的编码氨基酸序列已注册到GeneBank，注册号为AF143675。

　　3.Z10株M片段的全基因序列与其它汉坦病毒的比较：应用J. Hein方法将Z10株的M片段全基因与GeneBank报告的28株汉坦病毒M片段的全基因进行序列同源分析，结果Z10株与HTN型同源性为83.6%～87.4%，与SEO，DOB和Thai型为69.5%～70.8%，而与PUU和HPS各型病毒同源仅为57.6%～59.9%，结果表明Z10株属HTN型。Z10株与28株各型病毒同源性比较分析结果见表2。

　　4.推导的M片段氨基酸序列与其它汉坦病毒的比较：Z10株的M片段全基因推导的氨基酸序列与GeneBank报告的28株汉坦病毒 M片段的全基因推导的氨基酸序列进行序列同源分析，结果Z10株与7株HTN型同源性为94.2%～96.0%，与SEO，DOB和Thai型同源性为73.3%～76.6%，而与PUU和HPS各型病毒同源性仅为53.2%～56.3%，比核苷酸序列同源性低。Z10株与各型病毒比较分析结果见表3。在与同型的7株HTN病毒比较时发现Z10株有16个氨基酸与它们差异，见表4。

　　5.进化发生树比较分析：应用J. Hein方法进行系统发生分析绘出了29株汉坦病毒核苷酸和氨基酸的系统发生树(见图3、图4)。从进化树结果也可以看到Z10株病毒与汉滩以外的病毒距离较远，而与汉滩病毒在一个分支，属于汉滩型病毒，但其区别于其它汉滩病毒，为一新的亚型。

　　讨论

　　我们应用PCR的方法从感染病毒的细胞中得到了Z10株M片段的全长cDNA，序列测定结果表明，Z10株M片段由3 615个核苷酸组成，单一读码框架编码1 135个氨基酸。同已报道的汉坦病毒M片段基因比较表明，Z10株与HTN型病毒类似，核苷酸同源性为83.6%～87.4%，氨基酸同源性高达94.2%～96%，而与其它汉坦病毒同源性则较低，表明Z10株为HTN型，这与我们应用空斑减少中和试验和

　　图1　Z10株M片段全基因序列

　　Fig 1. Sequence of the M genome segment of Z10 strain

　　图2　Z10株M片段基因推导的编码氨基酸序列

　　Fig 2. Encoding amino acid sequence of the M genome segment of Z10 strain

　　表2　Z10株M片段与28株汉坦病毒核苷酸同源性比较分析

　　Table 2. Comparison of M genome segment of Z10 strain nucleotide sequence homology with 28 Hantaviruses

　　表3　Z10株M片段与28株汉坦病毒氨基酸同源性比较分析

　　Table 3. Comparison of M genome segment of Z10 strain amino acid sequence homology with 28 Hantaviruses

　　PCR分析的型别结果完全一致^〔3，9〕。以Z10株与文献报道^{〔7,10-13〕}的8株HTN型病毒M片段全序列核苷酸同源性比较发现，Z10株与国外毒株76-118，hojo等为83.6%～84%，与国内其它毒株A9、HV114也仅为87.3%，87.4%，而国外毒株间的同源性高达94.7%～99.7%，国内A9、HV114株间高达99.5%，国内A9、HV114株与国外毒株同源性也仅为83.6%～84.7%。虽然这些毒株间核苷酸有较大的差异，但同型间的氨基酸同源性仍在94%以上，这与血清学试验同型间的交叉中和作用都很好，有一致关系。另据文献报道^〔14〕，根据M片段G2区基因的330个核苷酸的比较结果，我国的HTN型分离株存在3个亚型，A9是其中的一个亚型。本文报道的M片段基因序列分析结果表明，Z10与A9的差异达12.7%，因此说明，Z10株既不同于国外毒株又不同于国内一些毒株，属另一个亚型。从系统发生分析的结果也可以看到Z10株与HTN型国内毒株亲缘关系较近但又不相同，而与国外毒株则较远。Z10株具有高的血凝活性和良好的免疫原性，免疫动物和人体后的中和抗体水平高且稳定。该生物学特性是否与Z10株存在16个独特的氨基酸有关尚待进一步研究。我们构建的M片段的全长cDNA克隆和全基因序列测定结果不仅为研究我国出血热毒株的生物学特性、致病机理等提供了分子基础，而且将为发展基因工程疫苗，包括DNA疫苗提供可能。

表4　Z10株与其它7株HTN型病毒M片段氨基酸的差异

　　Table 4. Amino acid differences in the M segment of Z10 stran with other 7 strains HTN type virus

Position	Other HTN strains	Z10 strain
13	V	A
71	L	M
80	V	I
87	D	E
92	S	G
222	I	L
231	E	Q
504	I	V
547	V	I
588	Y	C
635	F	C
690	K	R
768	S	A
804	R	K
817	I	V
1114	V	I

　　图3　Z10株M片段全基因核苷酸序列的系统发生树

　　Fig 3. Phylogenetic tree depended on the complete nucleotide sequence of Z10 M segment

　　图4　Z10株M片段氨基酸序列的系统发生树

　　Fig 4. Phylogenetic tree depended on the amino acid sequence of Z10 M segment

　　参考文献

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(收稿日期：1999-07-24)