从四例丙肝患者系列血清标本分析HCV基因的变异

从四例丙肝患者系列血清标本分析HCV基因的变异

中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 病毒学

作者：张庶民　庄辉　李河民　Anders Widell　祁自柏　张华远

单位：张庶民 李河民 祁自柏 张华远(中国药品生物制品检定所)；庄辉(北京医科大学微生物学系)；Anders Widell(瑞典伦德大学马尔默总医院微生物学系)

关键词：丙型肝炎病毒；基因型；膜区基因

　　【 摘要 】　目的　研究丙型肝炎病人系列血清标本的丙型肝炎病毒（HCV）基因型变化及HCV膜区基因变异和“准种”现象。方法　对4例因献血感染HCV病人的系列血标本，用特异性引物PCR扩增检测，5′-NCR和核心区测序确定HCV基因型，并对标本膜区基因进行克隆，每个标本随机选择5～9个克隆进行测序分析。结果　发现随着时间推移，存在HCV基因型的转换现象。在2种HCV基因型转换期存在混合感染。所有测定序列均为1b或2a或1b+2a基因型。对从部分血样中获得的5～9个克隆测序表明，在不同克隆间虽然存在一定的核苷酸差异，但在570nt长度的序列中，仅有0.8～4.56个核苷酸差异。结论　HCV基因变化是多层次的。同一病人可混合感染不同基因型HCV，HCV膜区基因有随时间而发生变异现象。但在本研究的标本中，通过对同一标本基因多个克隆的序列测定，未见明显的“准种”现象。

Study on HCV gene variation

ZHANG Shumin, ZHUANG Hui, LI Hemin, et al.

　　(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　To study the HCV genotype change in the serial sera of patients with hepatitis C, HCV gene variation and quasi-species.Methods　Serial sera of four patients with hepatitis C were collected from 1994 to 1997. HCV genotyping, direct sequencing and multiple-clone sequencing were performed.Results　The genotype change was found with time in 3 patients. During the switching period of two genotypes, 2 patients had a co-infection of 1b and 2a for short period. All the tested samples were 1b, 2a or 1b+2a. Five to nine clones obtained from the same serum were sequenced. Although some nucleotide variation was found in different clones, only 0.8-4.56 of 570 nucleotides were different.Conclusions　Co-infection of different HCV subtypes may occur in the same patient. HCV envelope gene of the subtype changes with time. No obvious quasi-species phenomenon was found in the patients with hepatitis C. HCV gene variability exists at different levels.

　　【 Subject words 】　HCV; Genotype; Envelope gene region

　　丙型肝炎病毒(HCV)是一正链RNA病毒，属于黄病毒科，基因的多变性是其重要特征。HCV基因变异主要表现在四方面：即基因型、亚型、准种和不同毒株^〔1〕。目前，世界范围内的HCV株主要分为六大型，型之下又分不同亚型。型别的分布与地域有很大关系^〔1〕。我国主要以2a和1b型为主。在HCV基因结构中, 膜区是变化最大的区域，尤其是位于E2区5′端的HVR区变化最大，推测该区是与HCV疫苗研制有关的主要区域。“准种”是HCV变异的另一个重要特点。“准种”是指在病人体内一群同源性较大的病毒株的总和^〔2〕，推测HCV的慢性化是由于“准种”逃避宿主的免疫压力，此消彼长的结果。但也有不同看法，认为病人体内 “准种”可能是由于实验误差造成的^〔3〕。为研究HCV基因型别在个体内随时间的变化情况、探讨HVR随时间变化的规律和准种现象，我们对4例因献血感染HCV病人的系列血清进行了研究。现将结果报告如下。

　　材料与方法

　　标本来源：4例因献血感染HCV病人（A、B、C、D）的系列血清采自中国某地。A：男，38岁；B：男，44岁；C：男，51岁；D：女，42岁。4名病人从1994年开始在血站献血浆时即开始留存血清样本，一直采至1997年。4人中除B和D为夫妻外，另2名彼此无接触机会。血清标本保存于-70℃备用，样品根据年、月、日编号。

　　HCV RNA检测：引物根据5′非编码区设计（见表1）。HCV RNA用冷酚法从100μl血清中提取，提取后RNA经75%乙醇3次洗涤后，溶于30μl DEPC处理水中(含20U RNAsin)，分装每管10μl，保存于-70℃备用。逆转录和第一次PCR扩增在同一管中完成。42℃ 1 h完成逆转录后，95℃灭活5 min，开始循环，参数如下：95℃ 1 min 30 s，50℃ 2 min，72℃ 3 min，35个循环后，72℃延伸5 min。取5μl第一次扩增产物参加第二次扩增，参数为：95 ℃ 1 min，55℃ 1 min，35个循环后，72℃延伸5 min。

表1　HCV检测、分型及膜区扩增引物

　　Table 1. Primers for amplification and sequencing of HCV

Primer	Purpose	Primer sequence(5′-3′)	Position	Product size
		HCV RNA diagnostic
R1	O, F	GGCGACACTCCACCATAGATC
R2	O, R	CATGGTGCACGGTCTACGAGAC		330bp
R3	I, F	GGAACTGTCTTCACGCAGA
R4	I, R	TCGCAAGCACCCTATCAGGCAG		263bp
		HCV typing assay
T1	O, F	TAGATTGGGTGTGCGCGCGA
T2	O, F	CAGGTTGGGTGTGCGCGC
T3	O, R	ATGTACCCCATGAGGTCGGC		285bp
		Reaction A
TA1	I, F	AGGAAGACTTCCGAGCGGTC
TA2	I, R	TGGGGATAGGCTGACGTCTACCT		52bp	1a
TA3	I, R	CCATCCTGCCCACCCCA		141bp	1b
TA4	I, R	CCAAGAGGGACGGGAACCTC		173bp	2a
TA5	I, R	GCAACCCTCGTTTCC(GA)TACAGAG		126bp	2b
		Reaction B
TB1	I, R	GCAIGTIAGGGTATCGATGACIT
TB2	I, F	GTGTGCGCGACGCGTAAA		248bp	3a
TB3	I, F	AACCTCGTGGAAGGCGACAA		214bp	1b
TB4	I, F	AGCCCCAGGGCAGGCA		187bp	6a
		Envelope gene amplification
HVR05-1b	F, O	CGCATGGCATGGGACATGAT	1290-1309
HVR03-1b	R, O	GGAGTGAAGCAATACACTGG	1873-1854
HVRI5-1b	F, I, S	GGGACATGATGATGAACTGG	1300-1319
HVRI3-1b	R, I, S	GTGAAGCAATACACTGGGCCACA	1870-1848
HVR05-2a	F, O	CGCATGGCCTGGGAYATGAT	1290-1309
HVR03-2a	R, O	GGAGTGAAGCAGWACACYGG	1873-1854
HVRI5-2a	F, I, S	GGGAYATGATGATGAACTGG	1300-1319
HVRI3-2a	R, I, S	GTGAAGCAGTACACYGGRCCRCA	1812-1794
HSP 25-2a	F, I, S	CTTCTCTATGCAGGGAGCGT	1422-1442
HSP 23-2a	R, I, S	TTATCCTCGTATTGTAAAGCGC	1770-1749
HSP 25-1b	F, I, S	TACTATTCTATGGTGGGGAAC	1422-1442
HSP 23-1b	R, I, S	GCTCAGCATAAGTGATGGGAC	1770-1750
PBAD F	S	ATGCCATAGCATTTTTATCC
PBAD R	S	GATTTAATCTGTATCAGG

　　Note: F: forward; R: reverse; O: outer; I: inner; S: sequencing　　HCV基因分型：HCV基因分型采用文献〔4〕方法，第二次反应分别在A、B管中进行，根据扩增产物长度判断型别。逆转录和第一次PCR扩增与HCV RNA检测相同。第二次扩增参数为：95℃ 1 min，63℃ 1 min，72℃ 1 min 30 s。产物经4% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，UV灯下观察。

　　HCV膜区基因扩增：从GeneBank中调出1b和2a型HCV膜区基因序列，用Multi-align软件比较所有同型基因序列，找出保守区域。由于同型HCV基因也存在变异，因此，设计了简并引物。根据型特异性还设计了不同基因型膜区扩增引物，以HVR命名。首先利用HVR引物对血样本序列进行测定，根据已测定的序列又设计了特异性较高的引物，命名为HSP。在检测中利用HVR内引物作为HSP的外引物，而HSP引物作为内引物进行扩增。HCV基因膜区序列设计引物见表1。

　　HCV RNA提取、逆转录和第一次PCR扩增与HCV RNA检测相同。取5μl第一次扩增产物参加第二次扩增，首先95℃ 5 min，之后开始循环，循环参数为：95℃ 1 min；52℃ 1 min 30 s；72℃ 3 min，35个循环后，于72℃延伸10 min。产物经4%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，UV灯下观察、检测。

　　所有样本均用两种基因型引物(1b和2a)进行交叉PCR扩增和测序，并与其它引物测序和克隆测序结果比较。

　　克隆：取1.5μl PCR纯化产物，与1μl pBAD-TOPO质粒（购自Invitrogen公司）混合，加水至5μl。轻轻将混合物混匀，室温静置，精确计时5 min，瞬时离心，将反应管放在冰上，即为连接液。连接液转化感受态细菌，将转化后细菌均匀铺于含50μg/ml氨苄青霉素的琼脂平皿上，置37℃下培育过夜。克隆和表达载体pBAD-TOPO的优点为直接连接PCR产物，不需要用连接酶，可节约时间。另外，其阳性克隆不是通过颜色确定，而是只要生长在平皿上的菌落均可能为阳性克隆。

　　克隆筛检

　　PCR扩增检测：随机挑选菌落转种于另一个含50μg/ml氨苄青霉素的琼脂平皿，37℃培养过夜，然后用接种针小心挑平皿上少许菌斑，搅入100μl纯净水中，于沸水中煮5 min，离心，取上清液10μl，作为扩增模板，直接做第二次PCR扩增，扩增产物于4%琼脂糖凝胶电泳，观察带形，并与分子质量标准和已知扩增产物比较，有目的带者为阳性菌落。

　　酶切检查：挑选PCR法检查阳性克隆接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃振荡过夜。用试剂盒小量提取重组质粒后，用EcoRⅠ内切酶酶切检查。

　　测序：纯化后扩增产物分别用扩增内引物循环标记荧光（PE公司试剂盒）后进行直接测序。克隆测序首先将目的质粒DNA小量提取，后用pBAD质粒上游（F）和下游（R）引物循环标记荧光，进行双向测序。测序用ABI373仪器完成。测定序列用Facturn和Sequence Navigator得出Consensus序列。序列比较用MacMolly和MultiAlign (INRA)软件完成，氨基酸翻译用Translate软件完成(Internet: http://www.expasy), 通过用Blast软件与GeneBank中已知型别序列比较确定测定序列型别。HCV参比基因为 D10934(1b)^〔5〕, L02836(1b)^〔6〕, D10075(2a)^〔7〕,D00944(2a)^〔8〕。

　　HCV抗体检测：用Abbott第三代诊断试剂，个别标本用第三代RIBA试剂确证(Ortho公司)。

　　实验监控：

　　(1)每一份血清标本平行做1份超纯水（Sigma公司）作对照，每6份血标本平行做1份弱阳性对照。所有对照标本从HCV RNA抽提，至以后各步均与检测样本同时完成。当对照无任何污染时判为实验合格。

　　(2)所有样本分批提取RNA，每次检测只抽提24个样本（12个血清标本，10个超纯水对照和2个弱阳性对照），以避免由于样本太多而引起的污染。

　　(3) 每次序列测定均加一已知质控对照，与测定样本平行测定。如质控对照结果有异，则重新测定。

　　(4)用于测序的PCR产物采用平行扩增的混合物，以切实反映病毒基因在宿主体内的存在状态。

　　(5)所有测序反应均采用双向、多引物测序，利用软件得出Consensus序列后进行比较，一旦发现双向测序有不符者，重新测定。

　　结果

　　1.病人的HCV抗体、HCV RNA和基因型变化：在4例病人标本中，只发现1b和2a型。病人A、B、C均有基因型别转换现象，在B、D病人中发现有1b、2a两型混合感染现象。以下分别叙述。

　　病人A从第一份血样A940415直到A9409xx一直为HCV抗体和HCV RNA阴性。从A950330开始HCV抗体和HCV RNA同时转阳。此时，5′-NCR序列分析显示其为基因1b型。从A960115直到A960510，HCV基因分型、5′-NCR和核心区测序均显示感染2a型基因。从A961115直到最后一份样本A9705xx期间，HCV分型、5′-NCR和核心区基因测序又转为1b基因型（见表2）。

　　病人B从第二份样本B940402开始HCV抗体和HCV RNA同时转阳，样本的5′-NCR序列测定显示为1b基因型，从B940516至B940928约4个月期间，HCV抗体阳性，但HCV RNA阴性。在B9501xx至B951216间，HCV抗体和HCV RNA均为阳性，基因分型、5′-NCR和核心区测序均显示其为2a基因型。B960120和B960210　2份标本的基因分型显示为1b和2a基因型混合感染，而此2份样本的5′-NCR和核心区测序均显示为1b型。该病人从B960915直到最后样本B9705xx为HCV抗体持续阳性而RNA转阴（见表3）。

表2　病人A的系列血清标本检测结果

　　Table 2. The test results of the serial samples of patient A

Sample	Date	Anti- 　　HCV	HCV 　　RNA	Typing	5′-NCR 　　seq	Core 　　seq
A940415	94.04.15	-	-
A940418	94.04.18	-	-
A940511	94.05.11	-	-
A940620	94.06.20	-	-
A940922	94.09.22	-	-
A9409xx	94.09	-	-
A950330	95.03.30	+	+	-	1b	-
A960115	96.01.15	+	+	2a	2a	2a
A960330	96.03.30	+	+	2a	2a	2a
A960510	96.05.10	+	+	2a	2a	2a
A961115	96.11.15	+	+	1b	1b	1b
A9705xx	97.05	+	+	1b	1b	-

　　seq=sequencing

表3　病人B的系列血清标本检测结果

　　Table 3. The test results of the serial samples of patient B

Sample	Date	Anti- 　　HCV	HCV 　　RNA	Typing	5′-NCR 　　seq	Core 　　seq
B940115	94.01.15	-	-
B940402	94.04.02	+	+	ND	1b	ND
B940431	94.04.31	+	+	ND	1b	ND
B940516	94.05.16	+	-
B940603	94.06.03	+	-
B940624	94.06.24	+	-
B940719	94.07.19	+	-
B940730	94.07.30	+	-
B940830	94.08.30	+	-
B940928	94.09.28	+	-
B9501xx	95.01	+	+	2a	2a	2a
B9508xx	95.08	+	+	2a	2a
B951216	95.12.16	+	+	2a	2a	2a
B960115	96.01.15	+		1b,2a
B960120	96.01.20	+
B960210	96.02.10	+	+	1b,2a	1b	1b
B960220	96.02.20	+
B960310	96.03.10	+			1b	1b
B960505	96.05.05	+	+	-	ND	-
B960915	96.09.15	+	-			-
B961115	96.11.15	+	-			-
B970105	97.01.05	+	-			-
B9705xx	97.05	+	-			-

　　seq=sequencing　　病人C从C940124至C940302 HCV抗体持续阴性，但HCV RNA阳转，其后HCV RNA呈间歇阳性至C950814，此后HCV RNA持续阳性。HCV抗体自C940515转阳后一直为阳性。从样本C940302至C940603基因分型、5′-NCR和核心区测序均证明此阶段为1b基因型；从C950814直到C970217为2a基因型（见表4）。

　　病人D从D940516直到D9508xx，HCV抗体和HCV RNA持续阴性，样本D960115二者同时阳转，HCV抗体阳性持续至D9705xx，而此时HCV RNA转阴。样本D960115和D960310基因分型显示为1b和2a混合感染，而5′-NCR和核心区测序显示为1b型。从D960505开始，病人D的基因分型、5′-NCR和核心区测序均证明为1b基因型感染（见表5）。

表4　病人C的系列血清标本检测结果

　　Table 4. The test results of the serial samples of patient C

Sample	Date	Anti- 　　HCV	HCV 　　RNA	Typing	5′-NCR 　　seq	Core 　　seq
C940124	94.01.24	-
C940128	94.01.28	-
C940302	94.03.02	-	+	1b	1b	1b
C940325	94.03.25	-	+	1b	1b	1b
C940515	94.05.15	+	-
C940603	94.06.03	+	+		ND	1b
C940617	94.06.17	+	-
C940831	94.08.31	+	-
C941023	94.10.23	+	-
C950814	95.08.14	+	+	2a	2a	2a
C950926	95.09.26	+	+	2a	2a	2a
C960103	96.01.03	+
C960201	96.02.01	+	+	2a	2a	2a
C960508	96.05.08	+	+	2a
C961010	96.10.10	+	+	2a	2a
C961210	96.12.10	+	+	2a		2a
C970217	97.02.17	+	+	2a	2a	2a

　　seq=sequencing

表5　病人D的系列血清标本检测结果

　　Table 5. The test results of the serial samples of patient D

Sample	Date	Anti- 　　HCV	HCV 　　RNA	Typing	5′-NCR 　　seq	Core 　　seq
D940516	94.05.16	-	-
D940624	94.06.24	-	-
D940719	94.07.19	-	-
D940728	94.07.28	-	-
D940831	94.08.31	-	-
D9508xx	95.08	-	-
D960115	96.01.15	+	+	1b,2a	1b	1b
D960310	96.03.10	+	+	1b,2a	1b	1b
D960330	96.03.30	+
D960430	96.04.30	+
D960505	96.05.05	+	+	1b	1b	1b
D9705xx	97.05	+	-

　　seq=sequencing　　2.应用不同引物检测部分标本膜区HCV RNA及基因型：选择几例样本利用PCR扩增法对其进行基因型检测，其中B940402、B960505为1b型基因，B9501xx、B951216及C病人的3份样本均为2a型。利用HVR及HSP系列引物交叉扩增和测序，与分型检测结果相同。而样本B960310和D960310用分型检测发现为1b和2a混合型，利用HVR引物交叉扩增和测序，均为1b型,未检测到2a型。说明后法分型的灵敏度不及前法，但用特异性更高的HSP引物进行扩增和测序，则检出了1b和2a型混合感染(见表6)。

　　3.克隆测序和直接测序比较及“准种”测定：将不同引物所测同一基因型序列和克隆测序结果进行比较，发现两种方法所测序列相同。比较从同一份血清获得的5～9个克隆测序结果，发现不同克隆间确实存在一定的核苷酸差异，但在570nt长度的序列中，最多有4.56个，最少仅0.8个核苷酸差异（见表6），且其变化无规律性。

　　表6　应用不同引物及克隆检测HCV基因型

　　Table 6. HCV genotyping using different primers and clones

Samples	HCV 　　genotyping	HVR 1b	HVR 2a	HSP 1b	HSP 2a	Cloning 　　number	Cloning sequence 　　genotype	Mutation rate 　　(nt/sequence)
B940402	1b	1b	1b	ND	ND	5	1b,1b,1b	1.60
B9501xx	2a	ND	2a	-	2a	5	2a,2a,2a	3.60
B951216	2a	2a	2a	-	2a	8	2a,2a,2a	3.50
B960310	1b, 2a	1b	1b	1b	2a	5	1b,1b,1b	2.00
B960505	1b	1b	1b	1b	-	5	1b,1b,1b	3.80
C950814	2a	-	2a	-	2a	5	2a,2a,2a	2.80
C961210	2a	2a	2a	-	2a	5	2a,2a,2a	0.80
C970217	2a	2a	2a	-	2a	5	2a,2a,2a	3.20
D960310	1b, 2a	1b	1b	1b	2a	9	1b,1b,1b	4.56

　　Note: Genic location of related region, 1b: 1 300-1 870 nt for sequence D10934; 2a:1 300-1 870 nt for sequence D00934

　　4.不同时点HCV膜区基因变化：将不同时点所测序列比较后，发现B病人不同时点的1b型膜区基因有氨基酸改变。同样C病人随时间推移也有核苷酸序列变异，并引起了氨基酸的改变，但其变异的程度小于B病人。该2例病人变异的最大部位在HVR区，其核苷酸序列的改变也引起了氨基酸的变异。

讨论

　　关于丙型肝炎病人系列血清标本的基因分型国内未见报道。我们应用不同方法（特异性引物PCR扩增检测，5′-NCR和核心区测序），首先对4例感染HCV病人系列血清标本的HCV型别进行了研究，发现随着时间推移，A例由1b→2a→1b; B例由1b→2a→1b+2a→1b;C例由1b→2a;D例由1b+2a→1b。由于研究对象曾为职业献血员，因此，推测病人可能在不同时间混合感染了不同基因型病毒株，在某一时期由于宿主的免疫压力以一种型别为主，另一种可能处于潜伏状态。在2种型别的转换期（约3个月）发现存在2种基因型HCV的共存现象，进一步证明了转换现象的存在，结果提示HCV不同基因型的转换首先与混合有关，其次可能是病毒逃避宿主免疫压力的另一种表现方式。

　　“准种”概念是在1991年对HCV膜区基因研究中提出的。Farci等^〔9〕通过克隆研究，发现病人体内准种多达十余种。但是也有不同看法，认为病人体内 “准种”可能是由于实验过程中误差造成的，如序列测定和克隆时产生的误差。本研究利用不同引物交叉测序和克隆后测序，发现虽有核苷酸改变，但变化程度较小，且核苷酸变化无规律性，比较其它研究结果，推测这些核苷酸变异可能主要是由克隆时大肠杆菌对外源基因的压力所致^〔10〕。有报道指出，对标本做4～10个克隆测序即可发现“准种”现象^〔11〕。本研究克隆数为5～9个克隆/每个标本，说明检测克隆数已达要求，但未发现明显的“准种”现象，说明本研究病例“准种”数量可能极少，如要发现，还需对每个标本做更多的克隆测序。本研究与Farci等报道不同，可能与宿主的免疫状态不同有关。Farci等的研究是采用黑猩猩，并用不同毒株多次感染，用抗膜区抗体免疫保护，而本研究病人未采取任何抗感染保护措施。病毒消长完全依赖自然发展，即病毒承受的压力较少，因此，产生“准种”的数量可能较少。

　　用直接测序和克隆测序未发现标本混合感染存在，可能：（1）与克隆数量相对较少有关；（2）在病人体内不同病毒株含量不同。由于特异性PCR灵敏度高，能捕捉到少量病毒株，但用特异性较低的HVR引物直接测序和克隆测序灵敏度低，只能测出占优势的毒株。

　　从同一病人的不同时点分离的同一基因型HCV膜区序列有一定变异，且此种变异导致了氨基酸的改变。关于该种变异的产生有两种可能性：（1）由于研究对象为职业献血员，他们多次献血，因此有感染不同HCV基因株的可能。B病人先后感染2次1b基因型，可能由此而来。（2）C病人仅感染2a型HCV，其基因变化较少，可能是由HCV基因本身变异所致。这种膜区基因核苷酸和氨基酸序列的变异是否引起抗原性改变或是否有一定的规律性，还有待进一步研究。

　　由本研究结果来看，HCV的变化是多层次的。首先是不同基因型的混合感染，其次可能是“准种”的变化，再次是基因序列的变异。

　　志谢：对王淑平医师在标本搜集中所做的大量工作和谷金莲同志在整理标本中所做的部分工作表示感谢。

　　参考文献

　　1，Simmonds P. Variability of hepatitis C virus. Hepatology, 1995, 21:570-583.

　　2，Purcell R. The hepatitis C virus: Overview. Hepatology, 1997, 26(3):S11-S14.

　　3，Smith DB, McAllister J, Casino C, et al. Virus' quasispecies': making a mountain out of a molehill? J Gen Virol, 1997, 78:1511-1519.

　　4，Zhang YY, Lok ASF,Chan DTM, et al. Greater diversity of hepatitis C virus genotypes found in Hong Kong than in mainland China. J Clin Microbiol, 1995, 33(11):2931-2934.

　　5，Wang Y, Okamoto H, Tsuda F, et al. Prevalence, genotypes, and an isolate (HC-C2) of hepatitis C virus in Chinese patients with liver disease. J Med Virol, 1993, 40 (3):254-263.

　　6，毕胜利, 白宪鹤, 丛勉尔, 等. 中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异. 病毒学报, 1993, 9(2):114-127.

　　7，Okamoto H, Kurai K, Okada S, et al. Full-length sequence of a hepatitis C virus genome having poor homology to reported isolates: comparative study of four distinct genotypes. Virology, 1992, 188(1):331-340.

　　8，Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, et al. Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C virus isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions. J Gen Virol, 1991, 72 (Pt 11):2697-2704.

　　9，Farci P, Shimoda A, Wong D, et al. Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmune serum against the hypervariable region 1 of the envelope 2 protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:15394-15399.

　　10，Forns X, Bukh J, Purcell RH, et al. How Escherichia coli can bias the results of molecular cloning: preferential selection of defective genomes of hepatitis C virus during the cloning procedure. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:13909-13914.

　　11，Brambilla S, Bellati G, Asti M, et al. Dynamics of hypervariable region 1 variation in hepatitis C virus infection and correlation with clinical and virological features of liver disease. Hepatology, 1998, 27(6):1678-1686.

(收稿日期：1999-09-24)