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肠产志贺样毒素的大肠杆菌菌株中小肠结肠炎耶尔森菌毒力岛基因irp-2的检测
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 细菌学
作者：程伯鲲 叶长芸 伍建宏 孙晖 赵斌秀 徐建国
单位：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所 卫生部医学细菌学重点实验室 北京，102206
关键词：肠产志贺样毒素；小肠结肠炎耶尔森菌；irp-2基因；杂交；聚合酶链反应
【 摘要 】 目的 了解肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌（ESIEC）菌株中的小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp-2的存在情况。方法 使用菌落原位杂交、DNA打点杂交和PCR扩增方法。结果 用菌落原位杂交的方法发现在检测从各地收集的371株ESIEC菌株中，67株和irp-2基因探针杂交，占18.06%。在这67株菌种中，64株菌可使用PCR方法扩增出irp-2基因，占95.5%。鉴于在一部分肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）中可检测到irp-2基因，因而检测了EIEC的侵袭性基因ipaB基因。在67株与irp-2探针杂交呈阳性反应的菌株中只有1株为ipaB探针杂交阳性。为了比较菌落原位杂交和DNA打点杂交方法的特异性，随机挑选了20株irp-2基因菌落原位杂交和PCR试验阳性的ESIEC菌株、20株菌落原位杂交和PCR试验阴性的ESIEC菌株，进行irp-2、ipaB的全菌DNA打点杂交试验。其中有38株菌的试验结果和菌落原位杂交结果一致，符合率为95%。结论 从我国不同地区分离的ESIEC菌株中可检出小肠结肠炎耶尔森菌毒力岛基因irp-2，比例达18.06%。irp-2+ ipaB-可以作为鉴定部分ESIEC菌株的指标之一。PCR方法和菌落原位杂交方法均可采用。
The pathogenicity island gene irp-2 of Yersinia enterocolitica was detected in enteric Shiga-like-toxin-producing and invasive E. coli isolated in China
CHENG Bokun, YE Changyun, WU Jianhong, et al.
(Priority Laboratory of Molecular Medical Bacteriology, Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206, P.R.China)
【 Abstract 】 Objective Detection of the pathogenicity island gene irp-2 of Yersinia enterocolitica species from enteric Shiga-like-toxin-producing and invasive Escherichia coli (ESIEC) strains isolated in various provinces of China.Methods Colony hybridization, DNA dot hybridization and polymerase chain reaction (PCR).Results
By colony blots, 67 of the 371 (18.06%) strains of ESIEC were hybridized with the irp-2 gene probe. The replicon of irp-2 gene was identified by PCR method in 64 of 67 strains (95.5%) hybridized with irp-2 probe. And, one of the 67 strains hybridized with ipaB gene probe of entero-invasive E. coli (EIEC). A few strains of EIEC have been proved to be irp-2 gene positive. 20 irp-2-positive and 20 irp-2-negative strains of ESIEC, demonstrated by colony hybridization and PCR methods were selected to test irp-2 and ipaB genes by DNA dot blots. 38 of 40 strains were shown to be identical.Conclusion The irp-2 of Yersinia species is widely existed among the ESIEC strains isolated in China, and the irp-2+ ipaB- could be used as one of the diagnostic marker for some strain that were named ESIEC before.
【 Subject words 】 ESIEC; irp-2 gene; Hybridization; PCR
近年来，在医学细菌学领域出现了一个新名词——毒力岛（pathogenecity island）〔1〕。毒力岛的发现和研究对了解细菌致病性和毒力因子具有重要的意义。毒力岛的两端具有插入元件、整合酶和重复序列的结构特点，提示DNA重组的可能性是存在的。这也可能是细菌进化的一个重要的推动力量〔1,2〕。另外，毒力岛和宿主细胞的G+C Mol%、密码使用的明显差异，也提示毒力岛可能是外源性的。目前认为水平性的基因转移可能会导致新的病原性细菌的产生。毒力岛的发现，使这一学说得到了广泛的支持〔1,2〕。1998年S.Schubert〔3〕等报道在一部分粘附性大肠杆菌（entero-adherent E.coli, EAEC）中发现有小肠结肠炎耶尔森菌HPI（high pathogenecity island）毒力岛的基因irp-2等，比例高达93％。在致病性大肠杆菌（entero-pathogenic E.coli，EPEC）、出血性大肠杆菌（entero-heamorrhagic E.coli, EHEC）、志贺菌等菌株中极少发现irp-2基因。叶长芸等报道，一部分由我们实验室发现和命名的肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌（entero-SLTs-producing and invasive E.coli，ESIEC)菌株也具有小肠结肠炎耶尔森菌的HPI毒力岛基因〔4,5〕。为了解ESIEC菌株中毒力岛的irp-2基因的存在情况，我们使用DNA菌落杂交、打点杂交和PCR方法，对从各地腹泻病患者粪便标本分离的、使用血清学方法鉴定为可疑的371株ESIEC菌株进行了检测。结果报道如下。
表1 371株ESIEC菌株的irp-2基因检测结果
Table 1. Detection results of irp-2 gene in 371 ESIEC strains
| Strains | Number of strains | Colony hybridization
positive（%） |
PCR positive | Identical rate of colony
hybridization and PCR |
|
| Province | Source | ||||
| Beijing | Diarrhea |
61 |
20（32.8%） |
20 |
100% |
| Liaoning | Diarrhea | 62 | 9（14.5%） | 9 | 100% |
| Food poisonning | 18 | 2（11.1%） | 2 | 100% | |
| Cattle and pig feces | 124 | 10（8.06%） | 10 | 100% | |
| Shandong | Diarrhea | 38 | 17（44.7%） | 17 | 100% |
| Chongqing | Diarrhea | 68 | 8（11.7%） | 5 | 62.5% |
| Total | 371 | 67（18.05%） | 63 | 95.5% | |
材料和方法
菌株来源：本实验中所用的371株待检大肠杆菌为北京市、辽宁省沈阳市、山东省、重庆市涪陵区腹泻病患者粪便标本，辽宁省沈阳市食物中毒患者粪便标本以及辽宁省沈阳市动物粪便标本中分离的用常规血清学及生化方法不能鉴定的大肠杆菌，经ESIEC分型血清初筛后的可疑ESIEC菌株。
主要试剂：地高辛标记和检测试剂盒，购自德国宝灵曼公司。Taq DNA聚合酶，购自上海生工公司。dNTP购自美国Promega公司。硝酸纤维素膜，购自北京化工学校附属工厂。
irp-2基因PCR引物〔3〕：由上海生工公司合成，序列：5′ AAGGATTCGCTGTTACCGGAC 3′；5′ TCGTC
GGGCAGCGTTTCTTCT 3′。
质粒提取：用本室常规改良质粒DNA提取方法〔6〕。
染色体提取：操作方法参见文献〔7〕。
菌落原位杂交、DNA打点杂交：操作方法参见文献〔7〕及Boenringer Mannheim公司DIG标记及检测试剂盒说明书。
PCR方法：参照文献〔7〕进行。irp-2基因PCR反应循环参数：首先94℃变性5 min，然后94℃ 1 min→62℃ 1 min→72℃ 1 min，进行30个循环，最后1个循环72℃延伸5 min。
结果
1.ESIEC菌株irp-2基因的检测：使用菌落原位杂交方法、用粗提的全菌DNA标本进行打点杂交方法和PCR方法，对371株ESIEC的分离菌株进行了耶尔森菌毒力岛基因irp-2的检测。结果见表1及图1～图5。
图1 DNA打点杂交结果(探针为irp-2基因)
Fig 1. Dot hybridization of the irp-2 probe with DNA of ESIEC strains
A1: positive control E.coli O42; A2: negative control E.coli HB101; Others: ESIEC strains
图2 DNA打点杂交结果(探针为ipaB基因)
Fig 2. Dot hybridization of the ipaB probe with DNA of ESIEC strains
A3: positive control s.f 2a 301; A2: negative control E.coli HB101; Others: ESIEC strains
图3 菌落原位杂交结果(探针为ipaB基因)
Fig 3. Colony hybridization of the ipaB probe with ESIEC strains
A2: negative control E.coli HB101; A3: positive control s.f 2a301; Others: ESIEC strains
图4 菌落原位杂交结果(探针为irp-2基因)
Fig 4. Colony hybridization of the irp-2 probe with ESIEC strains
A1: positive control E.coli O42; B1: negative control E.coli HB101; Others: ESIEC strains
重庆市涪陵区送检的标本中有8株与irp-2基因探针打点杂交呈阳性反应，这8株菌中只有5株为PCR阳性。为进一步确证这个结果，我们提取了这8株菌的染色体进行了DNA打点杂交，5株PCR阳性菌株的DNA打点杂交结果为阳性，3株PCR阴性菌株DNA打点杂交结果为阴性。说明菌落原位杂交存在假阳性结果的可能性，PCR方法的特异性更强，但菌落原位杂交方法操作简便，适用于大量菌种的鉴定，对杂交阳性菌株可用PCR方法确证。
2.和irp-2基因探针杂交的ESIEC菌株的ipaB基因的检测：根据文献报道〔3〕，约27％左右的EIEC与irp-2探针杂交呈阳性反应。为排除与irp-2探针杂交呈阳性反应的所检菌株为EIEC的可能性，我们以EIEC及志贺菌特异的ipaB基因作为探针与上述菌株进行杂交。在67株与irp-2探针杂交呈阳性反应的菌株中只有1株为ipaB探针杂交阳性，其余66株菌（98.5％）不和ipaB探针杂交。
图5 irp-2基因PCR结果
Fig 5. Result of the irp-2 gene polymerase chain reaction
MK: λDNA+HindⅢ; 1: positive control E.coli O42; 2: negative control E.coli HB101; Others: ESIEC strains
3.菌落原位杂交方法与使用粗提的细菌全DNA标本进行打点杂交的试验结果比较：为确证菌落原位杂交结果的可靠性，在菌落原位杂交的基础上又选取20株irp-2基因菌落原位杂交阳性和PCR阳性ESIEC菌株，及20株irp-2基因探针菌落原位杂交阴性和PCR阴性的ESIEC菌株，分别提取质粒和染色体进行DNA打点杂交，结果见表2。在所检测的20株菌落原位杂交阳性及PCR阳性菌株中，有1株为irp-2和ipaB基因打点杂交阳性。在20株菌落原位杂交阴性及PCR阴性菌株中有1株irp-2基因DNA打点杂交阳性，符合率均为95％（19/20）。说明菌落原位杂交及PCR方法用于鉴定ESIEC菌种，其结果是可靠的(见图1～图4)。。
表2 使用DNA打点杂交试验检测ESIEC菌株irp-2基因的结果
Table 2. Detection results of irp-2 geng in ESIEC strains by DNA dot hybridization
| Number of
strains |
Colony hybridization | PCR | DNA dot hybridization | ||
| irp-2 | ipaB | irp-2 | ipaB | ||
| 19 | + | - | + | + | - |
| 1 | + | - | + | + | + |
| 19 | - | - | - | - | - |
| 1 | - | - | - | + | - |
讨论
小肠结肠炎耶尔森菌的HPI毒力岛为45kb的DNA片段，一端与宿主菌染色体上的ansT-tRNA位点相邻，其主要的结构基因为irp2、irp1和fyuA，其中irp2和irp1编码两种高相对分子质量蛋白HMWP2和HMWP1，与耶尔森菌的铁摄取能力有关，fyuA基因编码鼠疫菌素受体，与耶尔森菌的鼠疫菌素敏感性有关。细菌摄取铁的能力为细菌表达完整毒力所必须〔1,3〕。和鼠疫耶尔森菌的HPI毒力岛相比，小肠结肠炎耶尔森菌的HPI毒力岛要小得多，缺失了一部分基因。Schubert等〔3〕在一部分粘附性大肠杆菌中存在着小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛的发现，启发我们考虑在ESIEC菌株中是否也存在着HPI毒力岛的可能性。
参照已经发表的irp2基因的序列设计引物，以小肠结肠炎耶尔森菌染色体为模板进行PCR扩增，以其280bp的特异产物作为探针，对ESIEC菌株进行了检测。在使用菌落原位杂交方法检测的371株菌中，67株和irp-2基因杂交，占18.06％。在这67株菌中，64株PCR检测阳性，占95.5％。试验结果说明，在一部分ESIEC菌株中存在着HPI毒力岛。
ESIEC具有侵袭HEp-2细胞的能力，缺乏EIEC的特异性侵袭基因ipaBCD；对HEp-2细胞可呈集聚性粘附；产生一种毒素，编码毒素的基因与SLT2基因有同源性，该基因位于噬菌体上〔4,5〕；能在实验动物中产生典型腹泻；也可在成人中引发腹泻〔8〕。1994年到1997年，我们对从山东、新疆、湖南等地腹泻患者粪便标本中分离的用常规方法不能鉴定的400余株大肠杆菌进行研究，发现其中20％为ESIEC。这一结果提示，ESIEC的分离率可能比其它五类致泻性大肠杆菌的分离率都高。因而，深入研究ESIEC对我国的腹泻病防治有着重要意义。
EAEC最初的定义是指对HEp-2细胞具有粘附作用的大肠杆菌。检测方法是HEp-2细胞粘附试验。对HEp-2细胞呈集聚性粘附的大肠杆菌被命名为肠集聚性粘附大肠杆菌（entero-aggregative E.coli, EAggEC）〔9〕。对于其它的EAEC菌株，目前还没有特异性的检测方法。同时，许多致泻性大肠杆菌都有对HEp-2细胞的粘附能力，如EPEC等。从这个现象来看，EAEC的命名还有待于商榷。对ESIEC来说，目前还没有可靠的、可推广的检测方法。血清型也不清楚。我们实验室发展的ESIEC初筛血清，只能够起到初步筛选的作用。在ESIEC菌株中发现有小肠结肠炎耶尔森菌的HPI毒力岛基因，说明ESIEC的情况比我们最初设想的要复杂得多。对ESIEC菌株的毒力因子、致病性质粒、以及HPI毒力岛基因的检测结果充分说明ESIEC菌株可能包括亚类。对EAEC和ESIEC之间的关系的认识也有待于进一步深入的研究。
鼠疫耶尔森菌的毒力很强。和鼠疫耶尔森菌的毒力岛相比，小肠结肠炎耶尔森菌的HPI毒力岛发生了缺失。在致泻性大肠杆菌中发现HPI毒力岛意味着什么，值得我们深入地研究。同时，EPEC和EHEC菌株都有LEE毒力岛。关于毒力岛的研究可能会对致泻性大肠杆菌的分类和致病机制的理解产生影响。
ESIEC在我国的分离率较高，irp-2基因阳性的菌株在各地送检的不同来源的菌株中可检出。检查HPI毒力岛可用PCR方法和菌落原位杂交法，两种方法结果的符合率为95.5%（64/67）。在鉴定少量菌种时可选用PCR方法，在鉴定大量菌种时可选用菌落原位杂交方法。在检测的371株菌中只有1株同时与irp-2及ipaB基因探针呈阳性反应。因此，可以先用irp-2基因探针检测待检菌株，再将杂交阳性菌株与ipaB基因探针杂交，irp2+ipaB-菌株为ESIEC，irp2+ipaB+菌株为肠侵袭性大肠杆菌。
基金项目：国家自然科学基金-杰出青年基金资助项目(39625001)
参考文献
1，Carniel E, Guilvout I, Prentice M. Characterization of a large chromosomal “high-pathogenicity island” in biotype 1B Yersinia enterocolitica. J Bacteriol, 1996, 178(23): 6743-6751.
2，徐建国．毒力岛和细菌毒力的进化．中华微生物学和免疫学杂志，1999，19（2）：169-171.
3，Schubert S, Rakin A, Karch H, et al. Prevalence of the “high-pathogenicity island” of Yersinia species among Escherichia coli strains that are pathogenic to human. Infect Immun, 1998, 66（2）: 480-485.
4，Xu Jian-Guo, Cheng Bo-Kun, Wu Yan-Ping, et al. Adherence patterns and DNA probe types of Escherichia coli isolated from diarrheal patients in China. Microbiol Immunol, 1996, 40（2）: 89-97.
5，徐建国，程伯鲲，吴艳萍，等．产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌的研究．中华流行病学杂志，1994，15（6）：333-338．
6，徐建国，刘志奇．一种改良的质粒DNA提取方法．中华流行病学杂志，1989，10（特刊11号）：257-260.
7，Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual 2nd ed. Clod Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
8，徐建国，赖心河，刘志奇，等．肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌（ESIEC）菌株F171的志愿者实验．中华流行病学杂志，1994，15（6－A）：9-14．
9，Nataro J, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Review. 1998, 11（1）: 142-201.
(收稿日期：1999-08-30)