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20例中国人HCVⅡ/1b型高变区1序列变异的动态观察
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 病毒学
作者：赵军 程云 苏琴 李静 段学章 刘茂昌 何江英 曹阳 付体权
单位：解放军302医院免疫室 北京，100039
关键词：丙型肝炎病毒；高变区1；序列分析
【 摘要 】 目的 动态研究中国人群HCVⅡ/1b型包膜蛋白E2/NS1高变区1(HVR1)序列变异规律、意义及影响因素。方法 应用逆转录巢式PCR技术从20例HCVⅡ/1b型感染的中国病人血清中扩增了HCV部分包膜区基因片段(nt1 449～1 586，HCV-J)，纯化后直接采用双脱氧链末端终止法进行序列分析。结果 中国人群HCV HVR1位于氨基酸(AA)384～410位，有6个较保守的AA位点：385位Thr，389、390、406位Gly，403位Phe，409位Gln。自然病程组核苷酸（nt）变异率每年［0～2.07（平均0.50）］×10-1个/位点，AA变异率每年［0～6.22（平均1.24）］×10-1个/位点，干扰素治疗组nt变异率为每年［0～5.03（平均2.31）］×10-1个/位点，AA变异率每年［0～10.7（平均4.40）］×10-1个/位点。干扰素治疗对HVR1区变异有较强的免疫选择作用，HVR1变异率高低与慢性肝炎的临床病程有一定联系，肝炎活动期变异明显。结论 对HCV HVR1区变异规律及其生物学意义的进一步研究将有助于了解HCV慢性感染机理、制定新的治疗方案及疫苗设计等。
Dynamic study of genotype Ⅱ/1b hepatitis C virus hypervariable region 1 sequence diversity in 20 Chinese patients
ZHAO Jun, CHENG Yun, SU Qin, et al.
(Department of Immunology, Institute of Infectious Disease, Beijing 100039, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective To study the sequence diversity of the hypervariable region 1(HVR1) in the putative envelope protein E2/NS1 of hepatitis C virus (HCV) in Chinese patients and its possible influencing factor.Methods The cDNAs (nt1449-1586, HCV-J) derived from sequential plasma of 20 patients infected with genotypeⅡ/1b HCV were amplified, purified and directly sequenced by using RT-nested polymerase chain reaction (PCR) and dideoxynucleotide chain termination method.Results The HVR1 was found in amino acid (aa) 384-410 positions of E2 protein, which had six highly conserved amino acids: Thr at position 385, Gly at position 389, 390 and 406, Phe at position 403 and Gln at position 409. The rate of nucleotide (nt) and amino acid sequence variation in natural course was 0-2.07 (mean 0.50) and 0-6.22 (1.24)×10-1/genome site/year. In the interferon (IFN) treatment group, the rate of nucleotide and amino acid sequence variation was 0-5.05 (2.31) and 0-10.74 (4.40)×10-1/genome site/year. The rate of sequence variation was also higher in patients with flare-up of their ALT levels.Conclusion Our data on sequence diversity of HVR1 should be useful to the understanding of HCV persistent infection, development of new treatment strategy and vaccine design.
【 Subject words 】 Hepatitis C virus; Hypervariable region 1; Sequence analysis
以往对HCV高变区1序列变异规律的研究多为对不同个体某一时间点上的横断比较，对HVR1变异的动态研究报道不多，且病例数较少。然而对HVR1变异的动态研究更能客观地反映HCV在体内的实际变异情况，并有助于对HCV慢性感染机理及其防治的研究。我们对20例中国人群中HCV感染病人体内HCV HVR1进行了间隔3～19个月动态观察，研究序列变异情况，并对其临床意义及可能的影响因素进行了分析。
材料和方法
血清标本：20例病人血清选自我院住院及门诊随访病人，来自北京及周围地区，起病前均无其它肝病史，随访期间经常规的临床及实验室检查排除HCV以外其它嗜肝病毒感染及非病毒性肝损害，并无输血、血制品、静脉使用毒品等再次感染HCV病史。病人均经抗-HCV、HCV RNA及HCV基因分型PCR检测阳性。其中男性16例，女性4例，年龄9～77岁，平均45.2±21.9岁。急性肝炎1例，慢性肝炎15例，肝硬变3例，肝癌1例，9例诊断经肝穿病理证实，13例有输血史，转氨酶平均71±54U/L（范围25～269U/L），10例（组2）随访期间经正规干扰素治疗（300～450万IU/隔日，疗程3～9个月），详细资料见表1。
表1 20例Ⅱ型丙型肝炎患者病例资料
Table 1. Clinical and biologic characteristics of 20 patients infected with genotype Ⅱ HCV
| Group | Sex | Age | Diagnosis | DD(y) | OD(mon) | TH(y) | ALT（U/L)
mean±s（range） |
HVR1 VR (10-1/site per year) | |
| nt | AA | ||||||||
| 1* | M | 30 | CH（M） |
1 |
18 |
1.4 |
75±52（21-164） |
0.09 |
0.27 |
| 2* | M | 68 | LC（A） | 1.9 | 19 |
- |
38±16（20-58） | 0.39 | 0.71 |
| 3* | M | 74 | LC（A） | 3 | 19 | 3 | 58±51（6-219） | 0.93 | 2.09 |
| 4* | M | 71 | CH（M） | 0.7 | 12 |
- |
38±39（9-139） | 0 | 0 |
| 5* | M | 77 | LC（A） | 13.4 | 4 | 13.7 | 40±48（11-171） | 0 | 0 |
| 6* | M | 43 | CH（M） | 8.5 | 5 | 8.8 | 50±16（36-78） | 2.07 | 6.22 |
| 7* | M | 61 | HCC | 0.6 | 14 |
- |
37±23（15-58） | 0.10 | 0 |
| 8* | F | 32 | CH（M） | 3 | 8 |
- |
78±46（23-158） | 1.48 | 3.33 |
| 9* | F | 63 | CH（M） | 6.3 | 9 | 7.5 | 113±87（37-321） | 0 | 0 |
| 10* | M | 60 | CH（L） | 2.5 | 3 | 4.4 | 47±9（37-60） | 0 | 0 |
| 11** | M | 9 | CH（L） | 1.8 | 7 |
- |
31±18(5-56) | 1.91 | 3.82 |
| 12** | M | 64 | CH（S） | 1.7 | 12 |
- |
119±54(59-181) | 0 | 0 |
| 13** | F | 26 | AH | 0.1 | 3 | 0.1 | 269±232(18-736) | 4.93 | 8.9 |
| 14** | F | 40 | CH（L） | 13 | 3 | 13.1 | 51±18(21-77) | 1.48 | 1.47 |
| 15** | M | 53 | CH（S） | 3 | 7 | 8.1 | 37±11(26-56) | 3.39 | 6.98 |
| 16** | M | 41 | CH（L） | 0.75 | 8 | 9.2 | 49±15(21-67) | 0.93 | 1.69 |
| 17** | M | 9 | CH(L) | 0.17 | 8 | 8.8 | 78±64(18-253) | 2.59 | 3.91 |
| 18** | M | 36 | CH（M） | 2.5 | 10 | 8.8 | 97±66(37-207) | 2.07 | 5.78 |
| 19** | M | 37 | CH（M） | 0.6 | 5 |
- |
93±99(21-271) | 5.03 | 10.7 |
| 20** | M | 9 | CH（L） | 11.7 | 6 | 12 | 25±13(13-52) | 0.74 | 0.76 |
| *: natural course group; **: IFN treatment group; DD: disease duration; OD: observation duration; TH: transfusion history; VR: variation rate; CH: chronic hepatitis; L: slight; M: moderate; S: serious; AH: acute hepatitis; LC: liver cirrhosis; A: active; HCC: hepatocelluar carcinoma Ⅱ型高变区引物设计、HCV RNA提取、逆转录、PCR扩增、模板纯化、序列测定及所用主要试剂：均参见文献〔1〕。
统计学分析：均由SAS软件相应过程处理完成。 结果 动态测定20例中国人Ⅱ/1b型HCV部分E2包膜区（含HVR1）基因片段(nt1 449～1 586，HCV-J)序列，其编码氨基酸序列变异情况见图1，各例HCV HVR1区（AA384～410）核苷酸及编码氨基酸变异率见表1，HVR1(AA384～410)各位点氨基酸变异率曲线见图2。 对基因变异可能的影响因素及相应的单因素和多因素统计学分析见表2。此外，干扰素治疗组与自然病程组间年龄差异有统计学意义(P值=0.006)，而转氨酶(P值=0.268)及观察时间(P值=0.07)差异无统计学意义。 讨论 本组序列以AA384～410变异最为明显。与横断研究相比〔1〕，HVR1区385位Thr，389、390、406位Gly，403位Phe，409位Gln等保守AA位点在本组动态研究中同样较稳定，384、399、405等位点变异明显。本组HVR1区nt改变均是替换，未见插入及缺失突变，并以异义突变为主，约占总变异的79.7%，其中自然病程组为85.3%，干扰素治疗组为77.7%，两组间差异无统计学意义(P值=0.458)。AA变异率大于nt变异率(P值＜0.05)，说明HVR1变异可能是在一定免疫压力下进行的〔6〕。此外，本组20例间变异率差别较大，部分序列在短时间内变异明显，并有周围保守位点的改变，推测优势株序列变异方式有两种：(1) 某些位点的变异累积；(2) 先前存在的劣势株经机体免疫选择成为优势株。需要指出的是，本文所提到的优势株并不一定是实际存在的单一病毒分离株，而可能是含不同序列的病毒群体的优势序列的集中表现。 |
| 图1 20例北京地区Ⅱ/1b型HCV部分包膜区(含HVR1)氨基酸序列(AA374～419)动态比较
Fig 1. Deduced amino acid sequence of part (AA374～419, contain HVR1) of genotype Ⅱ HCV envelope protein in 20 Chinese patients 表2 单因素和多因素统计分析结果（t检验或方差分析） Table 2. The results of univariate and multivariate analysis(t test and analysis of variance) |
| Influencing factor | Patients
(n) |
Average variation rate | t or F value | P value | F value | P value | |||||
| nt | AA | nt | AA | nt | AA | nt | AA | nt | AA | ||
| Sex | |||||||||||
| Female |
4 |
1.97±2.09 | 3.42±3.91 | 0.79 | 0.39 | 0.438 | 0.698 | ||||
| Male | 16 | 1.27±1.48 | 2.67±3.24 | ||||||||
| Age(years) | |||||||||||
| ＜18 | 3 | 1.75 | 2.84 | 6.83 | 7.03 | 0.007 | 0.006 | 47.8 | 23.0 | 0.0001 | 0.0001 |
| ≤60 | 9 | 2.39 | 5.02 | ||||||||
| ＞60 | 8 | 0.18 | 0.36 | ||||||||
| State of disease | |||||||||||
| Mild | 14 | 1.67±1.66 | 3.33±3.47 | 1.03 | 1.07 | 0.273 | 0.297 | ||||
| Serious | 6 | 0.80±1.32 | 1.64±2.76 | ||||||||
| Disease duration | |||||||||||
| ≤1 | 7 | 1.96 | 3.64 | 0.73 | 0.48 | 0.496 | 0.626 | ||||
| ＜5 | 8 | 1.27 | 2.84 | ||||||||
| ≥5 | 5 | 0.86 | 1.69 | ||||||||
| ALT | |||||||||||
| ≤40 | 7 | 0.93 | 1.73 | 1.46 | 1.74 | 0.260 | 0.206 | 15.7 | 8.61 | 0.0003 | 0.0036 |
| ＜80 | 8 | 1.20 | 2.36 | ||||||||
| ≥80 | 5 | 2.41 | 5.07 | ||||||||
| Transfusion history | |||||||||||
| Without | 7 | 1.27 | 2.67 | 0.57 | 1.04 | 0.578 | 0.376 | ||||
| ＜5 | 4 | 0.79 | 0.98 | ||||||||
| ≥5 | 9 | 1.79 | 2.44 | ||||||||
| Observation duration | |||||||||||
| ＜6 | 6 | 2.25 | 4.53 | 3.13 | 2.85 | 0.070 | 0.086 | ||||
| ＜12 | 8 | 1.64 | 3.29 | ||||||||
| ≥12 | 6 | 0.25 | 0.53 | ||||||||
| IFN | |||||||||||
| Without | 10 | 0.50±0.74 | 1.24±2.09 | -3.07 | -2.38 | 0.007 | 0.028 | 73.7 | 24.3 | 0.0001 | 0.0002 |
| With | 10 | 2.31±1.70 | 4.40±3.60 | ||||||||
Last four rank are results of multivariate analysis; The factor of age and IFN has no interaction
图2 HVR1区氨基酸位点变异率曲线
Fig 2. The graph of AA variation rate in each of HVR1 positions
HCV为RNA病毒，变异性大，其全基因组nt变异率约为每年(1.44～1.92)×10-3/位点〔2〕。HVR1在HCV各部分中序列变异最为明显，已报道的慢性HC病人HVR1区nt变异率约为每年(0.13～9.1)×10-1个/位点〔3，4〕，AA变异率约为每年(0.23～3.03)×10-1个/位点〔4，5〕。本组实验结果为自然病程组HVR区nt变异率每年［0～2.07(平均0.50±0.74)］×10-1个/位点，AA变异率每年［0～6.22(平均1.24±2.09)］×10-1个/位点。干扰素治疗组nt变异率为每年［0～5.03(平均2.31±1.70)］×10-1个/位点，AA变异率每年［0～10.7(平均4.40±3.60)］×10-1个/位点，均明显高于自然病程组。20例平均nt变异率每年(1.41±1.58)×10-1个/位点，平均AA变异率每年(2.83±3.28)×10-1个/位点。分析变异率个体差异较大的原因：(1) 病毒分离株本身的差异；(2) 病程的不同阶段，治疗方法及机体不同的免疫反应；(3) 观察间隔时间不同。由本组中可以看出，某一基因位点可有连续或往复变异，如果观察间隔时间过长则有可能掩盖这些变异，故在动态研究中观察间隔时间应尽可能短，以更确切地反映实际变异情况。本组观察间隔时间多为数月，相对较短。
对影响HVR1区变异率的单因素统计学分析表明，干扰素治疗、年龄因素有统计学意义，而性别、病程、有无输血史及输血时间、观察时间、病情严重程度对变异率无影响。转氨酶水平在单因素方差分析中无统计学意义，但多因素方差分析表明，转氨酶水平与HVR1区nt及AA变异率高低有联系（P值均小于0.01）Kursaki〔3〕等报道，HVR1区核苷酸变异率在肝炎活动期（ALT升高）为每年(1.54～2.24)×10-1个/位点，静止期为每年(0.13～1.21)×10-1个/位点。Kao〔5〕等报道，HVR1区氨基酸变异率在肝炎活动期为每年1.54×10-1个/位点，静止期为每年0.23×10-1个/位点，两者相差均有显著性。本组病人转氨酶正常、小于80U/L及大于或等于80U/L三组核苷酸变异率依次为每年0.93×10-1个/位点、每年1.20×10-1个/位点和每年2.41×10-1个/位点，氨基酸变异率依次为每年1.73×10-1个/位点、每年2.36×10-1个/位点和每年5.07×10-1个/位点，可见变异率随转氨酶升高而升高，说明HVR1区变异与肝病的临床病程有一定相关性。推测机体在肝炎活动期对病毒的免疫清除能力较静止期强，引起肝脏炎症反应和转氨酶水平的升高，病毒在机体免疫压力选择下加快变异以逃避免疫清除。
年龄在单因素及多因素分析时均有统计学意义，但有文献报道〔7〕，年龄对HVR1区变异影响不大。对年龄以≤18、≤60及＞60岁分组后Q检验，仅后两组间变异率有差异，且自然病程组内年龄大于及小于60岁两组间nt和AA变异率均无差异，P值分别为0.172和0.146。考虑可能由于如年龄偏大，在临床中多不予干扰素治疗，故病例选取后两组年龄有差异。因此本组年龄对HVR变异的影响实际上可能是由于干扰素治疗造成的，而干扰素能通过调节、增强机体免疫压力，加快HVR1区变异及HCV的免疫选择已得到证实〔8，9〕。本组资料中未发现会聚性变异，即特定的序列与干扰素治疗或特定的病程、病情程度有关，干扰素组与自然病程组变异曲线也基本相似，因此设想的干扰素敏感区可能不在HVR1区。
本组HVR1区内有相当数目的保守及相对保守位点，且某个残基的替代多是具有似理化性质的AA，说明变异在一定程度上又是保守的，即HCV的生存存在一些生物学限制，能够逃避机体免疫选择的不同序列的HCV数目是有限的，这就为设计一个含有限数目的不同HVR1序列的多价疫苗(型内或型间)及基因疫苗提供了可能。由于缺乏合适的实验模型，目前对HCV通过HVR1区变异逃避机体免疫清除的具体机制及HCV慢性感染的其它原因尚不明确，本实验仅对HCV HVR1变异规律及意义进行了初步探讨。我们目前正对上述病例继续跟踪，并拟扩大病例数及对其中重点病例进行多克隆测序以进一步分析其变异规律。总之，对HVR1变异的深入研究将有助于了解HCV的致病机理，制定新的治疗方案及疫苗设计等。
基金项目：全军95课题基金资助项目（96M174，98Z089）
参考文献
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(收稿日期：1999-09-17)