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人类疱疹病毒6、7型体外感染淋巴细胞对四种细胞因子分泌的影响
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第6期第20卷 细胞因子
作者：彭光勇 姚堃 任强 季晓辉
单位：南京医科大学微生物与免疫学教研室，210029
关键词：人类疱疹病毒6型；人类疱疹病毒7型；细胞因子；淋巴细胞
【 摘要 】 目的 研究人类疱疹病毒6、7型(human herpesvirus 6 and 7, HHV-6、HHV-7)体外感染对免疫功能的影响。方法 采用生物活性法或ELISA法分别检测了HHV-7 Glasgow、YY5 2株病毒及HHV-6 GS株感染脐血单个核细胞(CBMCs), 培养上清中细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-12 P70水平的动态变化。结果 3株病毒感染CBMCs后前2天均轻度抑制IFN-γ产生，然后此抑制作用逐渐消失；3株病毒均能平稳诱导IL-12 P70产生，但GS组诱生水平低于Glasgow及YY5组；3株病毒在接种后早期都能诱生IL-10，GS诱生IL-10水平高于Glasgow、YY5株；3株病毒均能较强地诱导CBMCs 产生TNF-α，但到达峰值时间Glasgow、YY5迟于GS株。结论 HHV-6、HHV-7感染早期都可以通过影响细胞因子的分泌影响免疫功能，但HHV-6影响程度强于HHV-7。
Effects on production of TNF-α, IFN-γ, IL-10 and IL-12 in lymphocytes infected by human herpesvirus 6 and 7 in vitro
PENG Guangyong, YAO Kun, REN Qiang, et al.
(Department of Microbiology and Immunology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, P. R. China)
【 Abstract 】 Objective To study the effects on lymphocytes immune function as infected by human herpesvirus 6 and 7 (HHV-6, HHV-7) in vitro.Methods Production of TNF-α, IFN-γ, IL-10 and IL-12 P70 induced by HHV-6 GS strain and HHV-7 Glasgow, YY5 strains in the supernatants of cord blood mononuclear cells (CBMCs) were evaluated by biological activity assay and ELISA.Results (1) The secretions of IFN-γ were slightly inhibited in CBMCs supernatants with HHV-7 Glasgow, YY5 and HHV-6 GS strains during 2 days after infection, then the inhibited effects disappeared. (2) Glasgow, YY5 and GS strains could strongly induce IL-10 secretion in cultural supernatants at early phase of infection, the amount of IL-10 induced by GS was higher than that of Glasgow and YY5 strains. (3) Glasgow, YY5 and GS strains could all induce IL-12 P70, but the production of IL-12 P70 induced by GS was lower than that by Glasgow and YY5 strains. (4) Glasgow, YY5 and GS strains could all strongly induce TNF-α secretion, but HHV-7 infected cultures reached the maximal level at day 3 and day 4 of infection, later than that of HHV-6 GS (at day 2 of infection).Conclusion These in vitro findings demonstrate that HHV-6 and HHV-7 could all perturb immune function by inducing the cytokines secretion at early phase of infection, but the effects of HHV-6 were much stronger than that of HHV-7.
【 Subject words 】 Human herpesvirus 6; Human herpesvirus 7; Cytokines; Lymphocytes
人类疱疹病毒6型(human herpesvirus 6, HHV-6)是1986年由Salahudd等首次从淋巴细胞增生及AIDS病人的外周血单个核细胞(PBMCs)中分离，HHV-7是1990年由Frenkel等首次从健康人PBMCs中分离，两者同属于人类β-疱疹病毒，都能感染淋巴细胞，以潜伏状态存在于人体中。近来研究表明，细胞因子网络的失衡所导致细胞免疫功能障碍，是胞内病原体长期感染的主要原因〔1〕。HHV-6 、HHV-7在体内长期潜伏感染是否与细胞因子网络平衡失调有关？我们研究了HHV-6标准株GS，HHV-7标准株Glasgow及我室最近分离的YY5株体外感染脐血单个核细胞(CBMCs)对TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-12 P70诱生的影响，并对其在病毒感染早期的作用作了初步探讨。
材料与方法
病毒株：HHV-6 GS标准株，HHV-7 Glasgow标准株，前者在HSB2细胞上、后者在SUPT1细胞上传代培养，由香港大学微生物学系惠赠。YY5株为我室从一肾病患儿唾液中分离的HHV-7中国南京株〔2〕，在CBMCs中传代培养。
细胞：(1)人脐血单个核细胞(CBMCs)，南京妇幼
表1 病毒感染后不同时间培养上清中IFN-γ含量
Table 1. The production of IFN-γ in infected culture supernatants at different days post infection （each group n=12,
| Groups | Days post infection | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| GS+CBMCs |
128.3±1.9* |
132.5±5.6* |
136.4± 7.9 |
124.4± 8.1* |
120.4±5.1 |
| Glasgow+CBMCs | 136.5±8.8 | 141.5±6.4 | 151.0± 7.5 | 136.7± 5.4 | 111.8±5.7 |
| YY5+CBMCs | 139.7±7.7 | 143.0±8.9 | 145.0±10.4 | 150.5± 5.5 | 128.6±7.5 |
| CBMCs | 149.3±9.6 | 156.7±7.2 | 152.3± 1.6 | 152.3±11.7 | 110.4±7.8 |
*P＜0.05 vs group CBMCs
表2 病毒感染后不同时间培养上清中IL-12 P70含量
Table 2. The production of IL-12 P70 in infected culture supernatants at different days post infection（each group n=12,
| Groups | Days post infection | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| GS+CBMCs |
64.3± 7.6# |
69.3±10.2 |
55.9±11.7 |
55.9± 7.2 |
57.6±14.3# |
| Glasgow+CBMCs | 94.2± 2.9*△ | 89.2± 5.9* | 87.6± 4.7#△ | 85.9± 5.0*△ | 74.2±10.4* |
| YY5+CBMCs | 89.2±14.3* | 84.2± 5.8* | 81.7±14.2 | 75.0± 8.9 | 85.9± 8.6*△ |
| CBMCs | 39.4± 5.7 | 47.6±10.3 | 49.3± 8.8 | 42.6±12.5 | 29.4± 7.6 |
*P＜0.01, #P＜0.05 vs group CBMCs; △P＜0.05 vs group GS+CBMCs保健院提供肝素抗凝脐血，Ficoll分离，在淋巴细胞生长液中培养。培养条件：20%新生牛血清的RPMI 1640，含PHA 40μg/ml，IL-2 10U/ml，谷氨酰胺2mmol/L，青、链霉素各100U/ml。(2)SUPT1、HSB2细胞系，来自香港大学微生物学系；L929细胞由南京军区军事医学研究所提供，用含10%新生牛血清的RPMI 1640传代培养。
试剂：(1)TNF标准品，为重组人TNF-α，Sigma公司产品。TNF-α单克隆抗体，第四军医大学金伯泉教授惠赠。放射菌素D，Sigma公司产品。（2）IFN-γ ELISA检测试剂盒，Sigma公司产品；IL-10、IL-12 P70 ELISA检测试剂盒，Genzyme 公司产品。
细胞因子检测标本的处理：用淋巴细胞生长液调分离的CBMCs为2×106细胞/ml，加于24孔培养板中，每孔1ml，分别接种GS、Glasgow、YY5病毒株100 TCID50/ml，并以同一批未接种病毒的CBMCs 作为未感染细胞对照，共用3批不同CBMCs，每批4个平行样本，共12个样本感染病毒，于5% CO2，37℃培养。收集感染后的24、48、72、96、120 h培养上清液,-70℃冻存待测。
TNF-α的检测
TNF生物活性法检测：参考文献〔3〕，用TNF敏感细胞株L929微量细胞毒试验进行检测。TNF活性单位，即50%细胞存活时的最高稀释孔吸光度（A）值在标准曲线上的对应数值，再乘以稀释倍数。
TNF－α中和试验：取感染上清液与TNF-α单抗按50∶1混合，37℃ 1 h，再用上法检测TNF活性。
IL-10、IL-12 P70、IFN-γ ELISA检测：取上述冻存上清液按试剂盒说明书要求检测。最小检测浓度，IL-12 P70为20pg/ml，IL-10为15pg/ml，IFN-γ为5pg/ml。
统计分析：结果为12个样本平均值，用
结果
1.HHV-6 GS、HHV-7 Glasgow、YY5株体外感染CBMCs产生IFN-γ动力学特征：由表1可见GS、Glasgow及YY5株感染CBMCs后24、48 h和对照组相比均轻度抑制IFN-γ产生，72、96 h各病毒组的IFN-γ诱生水平接近于正常对照组，到感染第5天各组产生IFN-γ量均显著下降，其中正常对照组的下降幅度最明显。但除感染24、48、96 h上清中，GS组与对照组差异有显著性外，其余各组间差异均无统计学意义。
2.HHV-6 GS、HHV-7 Glasgow、YY5株体外感染CBMCs产生IL-12 P70动力学特征：由表2可见，HHV-6 GS、HHV-7 Glasgow、YY5感染CBMCs后均能诱导IL-12 P70的产生，且随时间的推移，IL-12 P70量的变化较平缓。感染5 d中，3株病毒产生IL-12 P70量都高于CBMCs对照组；而GS株产生IL-12
表3 病毒感染后不同时间培养上清中IL-10含量
Table 3. The production of IL-10 in infected culture supernatants at different days post infection（ each group n=12,
| Groups | Days post infection | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| GS+CBMCs |
202.7±24.1* |
189.2±11.1 |
149.3± 9.1* |
79.5± 3.4# |
50.7± 9.6# |
| Glasgow+CBMCs | 139.7±11.7 | 196.0±20.9 | 157.4±17.4# | 94.5± 8.0# | 45.1± 6.8# |
| YY5+CBMCs | 129.7±15.6△ | 172.5±20.5 | 160.5±14.3* | 77.8±15.3# | 56.3±10.2* |
| CBMCs | 110.1±10.8 | 140.1±14.3 | 54.5±12.8 | 31.3± 7.0 | 19.1± 5.7 |
*P＜0.01, #P＜0.05 vs group CBMCs; △P＜0.05 vs group GS+CBMCs
表4 病毒感染后不同时间培养上清中TNF-α含量
Table 4. The production of TNF-α in infected culture supernatants at different days post infection（each group n=12,
| Groups | Days post infection | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| GS+CBMCs |
178.1±50.3* |
1000.0±150.2* |
354.2± 83.1# |
160.6± 43.0# |
119.8± 23.0 |
| Glasgow+CBMCs | 45.3±19.9#△ | 333.3± 30.2*◆ | 666.7± 86.7* | 324.4± 42.8# | 238.8± 39.0# |
| YY5+CBMCs | 58.2±23.9#△ | 259.9± 58.0#◆ | 784.1±126.3*△ | 1123.5±109.9#◆ | 684.8±128.0#◆ |
| CBMCs | 12.5± 3.6 | 33.8± 15.1 | 98.4± 31.2 | 24.1± 8.2 | 76.0± 26.4 |
*P＜0.01, #P＜0.05 vs group CBMCs; △P＜0.05, ◆P＜0.01 vs group GS+CBMCsP70的量始终低于HHV-7 Glasgow、YY5组。
3.HHV-6 GS、HHV-7 Glasgow、YY5株体外感染CBMCs产生IL-10动力学特征：由表3可见，HHV-6、HHV-7均诱导CBMCs产生IL-10。病毒接种后24 h，GS株诱导IL-10产生量明显多于YY5及CBMCs对照组；在接种后3～5 d，各病毒组产生IL-10 量均显著高于CBMCs对照组，但各病毒组间十分相近。
4.HHV-6 GS株、HHV-7 Glasgow、YY5株诱导CBMCs产生TNF-α动力学特征：由表4可见，在病毒感染CBMCs 24 h后，HHV-6 GS株即能明显诱导TNF产生，48 h左右达高峰，以后逐渐下降；在接种后1～4 d，TNF的活性均明显高于正常对照组。而HHV-7、YY5及Glasgow株产生TNF的峰值间迟于GS株，Glasgow在第3天出现峰值，YY5在第4天才出现峰值；且接种后1～5 d，TNF活性也明显高于正常对照组。中和试验表明，抗人TNF-α的单抗能显著中和L929细胞微量细胞毒试验所测的TNF活性。
讨论
HHV-6、7是近年发现的人类β-疱疹病毒，我室已先后在中国南京分离鉴定了HHV-6 和HHV-7的地方株CN和YY〔2，4〕。本文结果证实，GS、Glasgow、YY5株感染CBMCs早期均轻度抑制IFN-γ分泌；3株病毒都能诱生有生物活性的IL-12 P70，都能诱生IL-10及TNF-α，但各病毒株诱生细胞因子特点各不相同。
在抗病原微生物感染中，IFN-γ属于TH1类细胞因子，主要由活化的CD4+（TH1），CD8+ T细胞及NK细胞产生， 是单核巨噬细胞激活因子，通过加强单核细胞各种功能，在病毒感染过程中，介导细胞免疫，发挥重要抗病毒作用〔5〕。IL-10属于TH2类细胞因子，在小鼠主要由TH2细胞产生，在人主要由B 细胞和巨噬细胞产生，是重要的负调节因子，能抑制TH1类细胞因子的分泌，下调T细胞和单核巨噬细胞功能，抑制细胞免疫〔6，7〕。我们观察GS、Glasgow、YY5 3株病毒感染的CBMCs，发现两类病毒感染早期都轻度抑制IFN-γ分泌，诱生IL-10，从而削弱了TH1类反应，优势激活了TH2类反应。这一结果提示，HHV-6、HHV-7在体内感染是否也有同样的效应，使病毒难以被清除，而导致长期潜伏感染、细胞免疫功能降低及其所分泌的细胞因子失调。
IL-12是诱导TH1类细胞分化的重要因子，TNF-α是一个重要的炎症因子，在病毒感染急性期，通过各种机制发挥重要的抗病毒作用〔3，8，9〕。本实验研究发现，GS、Glasgow、YY5株感染CBMCs 早期都能诱生有生物活性的IL-12 P70及TNF-α，可能与病毒感染早期激活单核巨噬系统密切相关。另外，IL-10能明显地抑制IL-12、IFN-γ分泌，IL-12也能刺激IFN-γ分泌〔6,9〕，我们研究发现，HHV-6 GS对IFN-γ诱生的抑制作用较明显，且发生较早，这与GS和HHV-7 Glasgow、YY5诱生IL-10、IL-12的特点不同有关。GS诱生IL-10 的能力在感染后24 h显著高于Glasgow和YY5，而诱生IL-12的能力则基本上低于Glasgow和YY5，因而出现GS 对IFN-γ诱生的抑制作用较明显，尤其是在感染早期。同时，GS感染产生炎症因子TNF-α也显著早于HHV-7两毒株，显示HHV-6 GS株感染时造成细胞因子网络失调更为显著。提示HHV-6导致免疫功能紊乱的可能性明显高于HHV-7，与临床观察到的HHV-6的致病性较强、与某些疾病的相关性高于HHV-7的现象是一致的。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270034)；江苏省自然科学基金资助项目（BK97051）
参考文献
1，Gong JH, Zhang M, Modlin RL,et al.Interleukin-10 downregulates Mycobacterium tuberculosis induced Th1 responses and CTLA-4 expression. Infect Immun, 1996, 156(3):1138-1142.
2，姚
3，范萍，姚
4，陈斌，姚
5，Donnelly RP, Freeman SL, Hayes M. Inhibition of IL-10 expression by IFN-γ up-regulates transcription of TNF-α in human monocytes. J Immunol, 1995, 155(3):1420-1427．
6，Malefyt DW, Abrams RJ, Bennett B, et al. Interleukin 10 (IL-10) inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an autoregulatory role of IL-10 produced by monocytes. J Exp Med, 1991, 174:1209-1218.
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8，Perussia B, Chan SH, D'Andrea A, et al. Natural killer(NK) cell stimulatory factor of IL-12 has differential effects on the proliferation of TCR-αβ+, TCR-γδ+ T lymphocytes and NK cells. J Immunol, 1992, 149(11):3495-3502.
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(收稿日期：1999-07-02)