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The relationship between expression of oncogene proteins and HBeAg in chronic hepatitis B virus infection Hong Feng, Zhang Chunyun, Zhao Hongtao, et al. Jining first People's Hospital, Shandong Province 272111
Abstract To study the relationship between abnorma expression of oncogene protein and HBV replication, we detected the expression of protein products C-erbB-2 P185, ras P21 and tumorsuppressor gene product P53 and HBeAg in the serum of 64 patients with chronic HBV infection by using immunohistochemical technique and ELISA. The results were as follows. The positive detection rates of serum HBeAg in C-erbB-2 P185 and ras P21 oncogenes positive groups were 89.4% and 84.6% respectively, but only 20% and 48% in C-erbB-2 P185 and ras P21 negative groups. It suggested that there is a close correlation between the over-expression of C-erbB-2 P185, ras P21 and replication of HBV.
Key words: Oncogene Chronic hepatitis B Hepatitis B viral e antigen
采用LSAB免疫组化技术，检测了64例慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者肝细胞中癌基因蛋白C-erbB-2 P185、ras p21和抑癌基因蛋白P53的表达，同时检测血清HBeAg，以观察癌基因异常表达与HBV高复制指标HBeAg的关系。
1 材料和方法
1.1 标本及来源 慢性乙型肝炎患者64例来自济宁市第一人民医院和山东省立医院肝炎门诊部(1995年8月至1996年4月)。男47例，女17例，年龄14岁～60岁，其中20岁～35岁者占65.6%。HBV感染史为半年至5年，肝组织标本均为肝穿刺活检标本，皆经病理组织学确诊(按1990年第六届全国肝炎会议诊断标准)，计慢性活动性肝炎(CAH)21例，慢性迁延性肝炎(CPH)38例，未见明显肝组织异常及仅表现轻微非特异肝组织改变(ASC)5例。所有肝穿刺标本均经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，厚4～5μm。分别作HE和免疫组织化学染色，进行病理组织学及癌基因蛋白检查。
1.2 免疫组织化学检测
1.2.1 试剂来源 C-erbB-2单克隆抗体由德国Kdrl scechheimer教授馈赠。LSAB试剂盒为美国Zymed公司产品。P21单克隆抗体识别H-ras，K-ras和N-ras癌基因，P53单克隆抗体能识别野生型和突变型P53核蛋白，两者购自Boster公司。
1.2.2 试验步骤 石蜡切片常规脱蜡反水加0.1%抗生物素和0.01%生物素分别在室温下作用30分钟；加10%正常马血清，湿盒温育30分钟；弃血清，加1：100浓度第一抗体(0.3ml/片)4℃过夜；加生物素标记的第二抗体(1：200)，(0.3ml/片)37℃孵育30分钟；加3% H2O2(0.3ml/片)室温10分钟；加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素(LSAB复合物)(0.3ml/片)，(1：200)，37℃孵育1小时；加DAB+H2O2(0.3ml/片)显色5～30分钟。上述各步间均以10mmol/L pBS洗3次，然后苏木素复染、脱水、透明、封片。
1.3 对照组设计 以已知阳性的乳腺癌、胃癌、肝癌标本作为各癌基因产物的阳性对照；PBS代替一抗为空白对照组。
1.4 HBeAg的检测 采用ELISA方法，由厦门新创公司提供试剂盒，按说明书操作及判断结果。
1.5 结果判定 各癌基因蛋白按以下标准分为四级。阳性细胞数≤5%判为阴性；16%～25%判为+；26%～75%判为++；≥76%判为+++。
1.6 统计学处理 用χ2检验。
2 结果
癌基因蛋白表达与HBV高复制指标HBeAg的关系见表1。P53免疫组化染色以细胞核出现棕黄色为阳性。C-erbB-2 P185、ras p21免疫组化染色以细胞浆或细胞膜出现棕黄色微细颗粒为阳性(封三图版ⅠB)。
表1显示，HBV高复制指标HBeAg与癌基因蛋白C-erbB-2 p185和ras P21阳性表达密切相关，在P185和P21阳性表达组，血清HBeAg检出率分别达89.4%和84.6%，明显高于这两种癌基因蛋白阴性组的20%和48%，统计学处理，差异显著(χ2分别为15.2和5.6 P值均＜0.01)。
3 讨论
HBeAg是乙型肝炎病毒内核的主要结构蛋白，与HBV DNA的存在有很好的相关性［1，2］，血清中HBeAg阳性明确提示患者肝脏存在活动性HBV复制并有高度的传染性。本研究发现，癌基因蛋白C-erbB-2 P185和ras p21过度表达与血清HBeAg相关。表明C-erbB-2和ras癌基因的激活与HBV高复制状态关系密切，可能是HBV复制中的某些代谢产物与癌基因激活有关。国外学者发现HBV X蛋白和S/Pre S2蛋白可通过反式激活作用激活某些原癌基因［3］。最近有学者发现在肝细胞癌癌旁组织中，凡是出现游离型HBV DNA者，则癌基因表达明显增高，提示癌旁组织中原癌基因受乙肝病毒某些产物的调控和刺激而过量表达。
综上所述，乙肝病毒诱发肝细胞癌的过程在HBV感染的慢性肝炎阶段已经开始，癌基因蛋白的异常表达与HBV复制密切相关。病毒复制可能是HBV致肝癌的作用机制之一。
表 1 3种癌基因蛋白的表达及HBeAg的检测结果
Tab.1 Expression of 3 oncoproteins and results of HBeAg detection
| 组别
Group |
例数
Cases |
HBeAg | χ2 P | |||
| 阴性例数(%)
Positive cases |
阳性例数(%)
Negative cases | |||||
| C-erbB-2 P185 | ||||||
| 阳性例数
Positive cases |
47 | 5(10.6) | 42(89.4) | χ2=15.2 | ||
| 阴性例数
Negative cases |
5 | 4(80) | 1(20) | P＜0.001 | ||
| ras P21 | ||||||
| 阳性例数
Positive cases |
13 | 2(15.4) | 11(84.6) | χ2=5.6 | ||
| 阴性例数
Negative cases |
50 | 26(52.0) | 24(48.0) | P＜0.01 | ||
| P53 | ||||||
| 阳性例数
Positive cases |
11 | 1(9.1) | 10(90.0) | χ2=1.03 | ||
| 阴性例数
Negative cases |
53 | 12(22.6) | 41(77.4) | P＜0.25 | ||
参 考 文 献
1 Shuichi K, Roger H M, Stephen M F, et al. Detection of serum hepatitis B virus DNA in patients with chronic hepatitis using the polymerase chain reaction assay. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:312-316.
2 王作强，黄李华.PCR与ELISA检测乙肝病毒标志的比较.上海医学检验杂志，1994，9：216-217.
3 Lauer L L, Weid L, Hofschneider PH. Transcription factors AP-1, AP-2 and NFKB are mediators of the HBV pre S/S transactivator effect. Hepatology, 1991, 14:120-126.