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Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus infection in infants
SUN Liwei, JIAO Lixin, WANG Chengxun, et al.
Changchun State Hospital of Pediatrics, ChangChun 130061
【Abstract】 Objective To search for the molecular epidemiology of respiratory syncytial virus (RSV) infection in infants.Methods The randomly amplified polymorphism DNA (RAPD) technology was used to study 96 RSV strains isolated and identified from the patients in Changchun State Hospital of Pediatrics during 1992-1994 and 1 refrerence strain of M type.Results All strains were typable, four RAPD patterns were observed, different diseases have different types. 87.14% of the patients′ RSV strains had the same RAPD pattern(R1).Conclusion RAPD method is a rapid, easy and high resolution technique, with which we can know on the molecular level the microbial infection state. There was epidemic of R1 type infection during the period surveyed.
【Key words】 Infant Respiratory syncytial viruses Gene amplification DNA(RAPD)
呼吸道合胞病毒(RSV)感染极广，是婴幼儿严重下呼吸道感染的重要病原［1］。RSV属副粘病毒科肺炎病毒属，为非节段性负链RNA病毒。国外学者利用随机扩增多态DNA(RAPD)技术进行细菌流行病学研究，具有分型率及分辨力高的特点［2］。本研究利用RAPD技术对1992～1994年长春市儿童医院婴幼儿肺炎、毛细支气管炎与上呼吸道感染患儿RSV感染情况进行分析。
1 材料和方法
1.1 RSV标准毒株和RSV抗血清 由首都儿科研究所提供。
1.2 临床分离株 1992年11月至1994年5月从本院160名怀疑病毒性肺炎和毛细支气管炎及51名上呼吸道感染患儿鼻咽分泌物中分离并鉴定出96株RSV。
1.3 病毒分离 将标准株与分离株均感染Hela细胞，当细胞80%以上出现融合病变时收获病毒，用细胞刷刮下细胞，离心收集细胞沉淀，-20℃冻存备用。
1.4 病毒鉴定 用临床分离株与RSV抗血清进行中和试验。
1.5 病毒mRNA的制备 采用聚乙二醇沉淀法［3］。提取的RNA经紫外分光光度计进行定量。
1.6 随机引物 OPF-01：5′ACGGATCCTG3′。
1.7 cDNA合成 在用DEPC水处理的反应管中加入5×RT缓冲液4 μl，25 mM/L dNTP 1 μl, 100 mM/L DTT 2 μl, 25 pmol/L Primer 1 μl, 50U/L反转录酶1 μl, 40U/L RNasin 0.5 ml和3 μl病毒mRNA溶液，7.5 μl DEPC处理水，混匀，42℃反应30 min。
1.8 cDNA扩增 反应体系为50 μl，引物2.0 μmol/L、4种dNTP各125 μmol/L, MgCl2 5 mmol/L,模板2 μl，TaqDNA聚合酶1.5 U(上海复生生物工程公司)。在美国MJ公司PTC-150(带热盖)扩增仪上按以下程 序扩增：94℃30秒，36℃2 min，72℃2 min循环4次；94℃30 s，35℃2 min，72℃1 min循环37次；，72℃保温7 min。
1.9 扩增产物的检测 取10 μl扩增产物经1%琼脂糖(Promega产品，分子生物学级)凝胶(内含0.5 μl/ml溴化乙锭)电泳，50 v，恒压3小时，以X174-HaeⅢ为相对分子质量标准，确定产物片段的大小，透射式紫外仪记录并照相。
1.10 统计学处理 采用卡方检验，因为R2、R3、R4所在列理论数有三项小于1，故将其并为一列用校正卡方公式计算。
2 结果
2.1 RSV RAPD实验条件的优化 引物的筛选，我们从美国Operon公司十聚体脱氧寡核苷酸引物库中随机选OPF-01，OPF-07，OPF-05三对引物对RSV基因组cDNA进行扩增。结果OPF-01在浓度为2.0 μmol/L时扩增效果好，模板浓度为10-1～102fg均有扩增带。TaqDNA聚合酶量为1.5 U时RAPD条带最清晰。观察镁离子浓度的影响范围为2.0～5.0 mmol/L, 递增浓度为0.5 mmol/L.结果5.0 mmol/L时长短片段均能良好扩增。退火温度为35℃、36℃时灵敏度高特异性好。
2.2 RAPD的特异性和灵敏度 将RSV临床分离株传代6次，每一代RSV的RAPD图谱均相同；RSV-RAPD的最小检出限为0.1 fg。
2.3 RSV毒株的RAPD指纹图 标准株和96株临床分离株均有明显扩增带，共有4种不同的扩增带。图1为标准株和部分临床分离株带型。其中7、8、9号孔为R1型最多，为62株。可能在1992～1994年长春市儿童医院毛细支气管炎病人中流行R1型RSV。
图1 RSV RAPD图谱
Fig.1 RSV RAPD patterns
1:χ174/HaeⅢ marker. 2,3:R4. 4:R3. 5,6:R2. 7,8,9:R1. 10: Reference strain of RSV
2.4 不同疾病来源的RSV型 见表1。毛细支气管炎有61株，87.14%来源R1。
表1 96株RSV临床分离株RAPD带型分析
Tab.1 The RAPD patterns of 96 RSV strains
isolated from clinical patients
| 病种
Disease |
RAPD(株数) | |||
| R1 | R2 | R3 | R4 | |
| 毛细支气管炎Capillary bronchitis |
61 |
2 |
4 |
3 |
| 肺炎Pneumonia | 7 | 3 | 2 | 3 |
| 上呼吸道感染Upper respiratory tract infection | 5 | 1 | 3 | 2 |
| 合计Total | 73 | 6 | 9 | 8 |
注：三组间比较χ2=16.81, P＜0.01, 毛细支气管炎与肺炎比较χ2=12.41, P＜0.01
Notes: Comparison among three diseases χ2=16.81, P＜0.01; Comparison between capillary bronchitis and pneumonia χ2=12.41, P＜0.013 讨论
RAPD方法是新近发展起来的分子生物学技术，1990年由Welsh和McClelland［4］首创。其原理是用一条随机序列的短引物对基因组DNA进行PCR扩增。该技术不需要预先知道有关基因序列，具有普遍适用性。RAPD指纹图条带的数目、强度与退火温度、镁离子浓度、TaqDNA多聚酶及模板等实验条件有关。为提高RAPD的重复性和分辨力，必须对实验条件进行优化。本研究首先摸索了RAPD最佳实验条件，并对96株RSV临床分离株和一株标准株进行分析，100%有扩增带。
RAPD法自发明以来在许多领域得到应用，但国内外尚缺少用此技术对病毒进行研究者。RSV是RNA病毒，极不稳定，极易降解，所以RSV的研究相对比较困难。我们的研究成功地对RSV进行分离并鉴定、mRNA提取、cDNA合成及RAPD分析。发现四种基因型。RAPD技术分辨力高、快速简便，有助于从基因水平了解疾病的流行情况，是RSV分子流行病学研究的有用工具。
在120例毛细支气管炎患儿鼻咽分泌物中分离出70株RSV，其中61株RSV为R1型。对这一结果可有两种解释：一是这一时期的毛细支气管炎患者多为R1型RSV感染；二是R1型RSV易引起毛细支气管炎。如为后者，利用随机引物OPF-01进行RAPD分型，将对毛细支气管炎的感染监控及流行病学研究有明显的实用价值。
参考文献
1 董继华，江汉珍，周生华，等.呼吸道合胞病毒G基因的扩增.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15：355-357.
2 Kersulyte D, Strueiens MJ, Deplano A, et al. Comparison of arbitrarily primed PCR and macrorestriction (pulse-field gel electrophoresis) typing of pseudomonas aeruginosa strains from cystic fibrosis patients. J Clin Microbiol, 1995,33:2216.
3 郑永晨，梁东，傅文永.中华医学检验杂志，1990，13：91-93.
4 Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res, 1990,18: 7213.