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Relationship between HBV DNA serum level and acute exacerbation of the disease in chronic hepatitis B patients
ZHOU Xiaohui*, GAO Zhiliang, YAO Jilu. * Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515031
【Abstract】 Objective In this study, we evaluated the relationship between HBV DNA serum level and acute hepatic exacerbation of the disease in chronic hepatitis B patients.Methods A series of serum samples from 14 patients of acute exacerbation of chronic hepatitis B were analyzed for alteratieus in serum HBV DNA and alanine transaminase (ALT) level before, during, and after episode of an acute exacerbation. The serum HBV DNA concentrations were tested by the quantitative polymerase chain reaction (PCR) using the AmpliSensor assay.Results ①Serum HBV DNA average levle in 11 patients significantly increased from 7.148±2.008(logarithm) at 2～8 weeks before maximum injury of liver to 8.416±2.160 (logarithm), the time that ALT reached its peak, and then, following the declining of ALT level, decreaed to 6.093±1.428 (logarithm). In 9 of 11 cases, the HBV DNA peak value occurred before the ALT peak level or at the same time; ②Two patients who experienced several episodes of acute exacerbation showed that the appearance of acute hepatic injury and the relatively normal liver function occurred alternatively. Whereas, one patient with liver cirrhosis showed persistence of high level viremia in three episodes of acute exacerbation in one year.Conclusion ①This investigation revealed a clear correlation between increasing level of serum HBV DNA and actue exacerbation of patinets with chronic hepatitis B. The findings suggest that host′s immune response which causes acute exacerbation of liver injury in patients with chronic hepatitis B is triggered by the change of viremia and HBV replication; ②Patients with severe chronic active hepatitis and persistent hepatitis B virus repliation are at very high risk of rapid progression to cirrhosis.
【Key words】 Hepatitis B DNA Fluoroimmunoassay
慢性HBV感染者的临床谱可从无症状的携带状况、慢性肝炎到肝硬化、肝癌［1，2］。慢性肝病是最重要的问题。大部分的慢性乙型肝炎(CHB)患者显示出肝损害的急性发作与正常肝功能交替进行的模式［1］。慢性乙型肝炎的发作通常是自限性的，并多呈亚临床过程，如果没有进行血清生化检查，常被病人及医务人员疏漏。大多数患者发作后转为静止期，少数患者则不断反复并加重，致使肝脏病变持续进展，结果发展为肝硬化，甚至肝癌，并可出现肝功能衰竭而危及生命［3］。目前认为，慢性乙型肝炎病变活动的主要原因是HBV复制激发机体的免疫损害，其次可能是病毒的基因变异及重叠感染其它病毒等［4］。本研究采用荧光标记(AmpliSensor)方法，测定一组反复自发性急性发作的慢性乙型肝炎患者的血清HBV DNA含量，拟探讨HBV DNA含量在慢性乙型肝炎发作病程中的变化与病情发作的关系，为进一步研究慢性乙型肝炎反复发作及加重的病因和机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 病例选择 病例来自1996年1月～1998年4月中山医科大学附属三医院传染科住院和门诊病人，共14例(男性12例，女性2例)。年龄平均31.8(19～49)岁。临床诊断：慢性乙型肝炎13例；肝炎后肝硬化1例。诊断符合1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议—病毒性肝炎防治方案(试行)［5］。本组患者携带HBsAg均在一年以上(1～28年)，为自发性急性发作。发作时丙氨酸转氨酶(ALT)均增高2倍以上。发作频度1～3次/年，且伴有不同的自觉症状。患者无大量(酒精量＞50 g/日)饮酒史，治疗前后也无使用抗病毒药物、免疫抑制剂及抗肿瘤药物等病史。病例组均给予一般保肝对症治疗，均未使用联苯双脂等各种降酶药物。除有乙型肝炎病毒标志外，其它类型肝炎病毒感染标志均阴性。
我们收集了11例慢性乙型肝炎患者急性发作前、中和后的血清。还对3例慢性乙型肝炎随访观察1～2年，收集患者多次急性发作前、中和后的系列血清。5例献血员(甲、乙、丙、丁和戊型病毒标志阴性)的血清做为阴性对照。全部血清贮存于-30℃冰箱中备检。
1.2 实验室检查
1.2.1 常规检测肝功能：丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(T-BILI)、胆脂酸(TBA)和谷氨酰转肽酶(ALP)等。
1.2.2 采用ELISA方法检测HBsAg、HBeAg、抗-HBc、抗-HBe、抗-HBs、抗-HBc IgM、抗-HAV IgM、抗-HCV(IgM和IgG)、抗-HEV(IgM和IgG)、HDAg、抗-HDV和抗-HD IgM、抗-HGV、抗-CMV(IgM和IgG)、抗-EBV(IgM和IgG)。
1.2.3 采用PCR方法检测HBV DNA、HCV RNA和HGV RNA。
1.2.4 全部病例行腹部、肝脏、胆囊、脾脏及胰腺“B”超检查。
1.2.5 血清HBV DNA含量测定：
采用美国Biotronics公司建立的AmpliSensor方法进行血清HBV DNA的定量检测［6，7］。检测灵敏度500拷贝/毫升。
1.2.5.1 不对称引物：
引物A：5′-TGC TCG TGT TAC AGG CGG GGT-3′
引物B：5′-GAG GCA TAG CAG CAG GAT GAA GAG-3′
1.2.5.2 信号引物：5′-TCG CTG GAA GTG TCT GCG GCG-3′
1.2.5.3 操作步骤：
(a).提取HBV DNA(ACUPURE DNA/RNA Extraction Kit, 美国Biotronics公司)。
(b).采用不对称引物进行PCR扩增：预变性90℃ 20 s，然后95℃ 25 s 60℃ 25 s、72℃ 30 s。最后72℃延伸1分钟。共19个循环。
(c).加入信号引物扩增：按上述条件循环。每3个循环用AG9600 AmpliSensor DNA分析仪测定一次信号引物能量转移情况。依据纯化的HBV DNA建立的标准曲线，通过计算机采用ASAP专用软件自动分析，直接读取HBV DNA初始模板数。
1.3 统计分析 假设检验采用单因素方差分析及Newman-Keuls检验两两比较，检验水准a=0.05。所有统计学分析用SPSS软件完成。
2 结果
2.1 11例慢性乙型肝炎急性发作前、中和后的血清HBV DNA含量 11例患者血清HBV DNA平均水平在ALT高峰期前(ALT:69.0U/L±56.9U/L)2周～2月为7.418U/L±2.008(对数值)；至ALT高峰期(ALT：480.1U/L±477.6U/L)为8.416±2.160(对数值)；在3周～5月之后，随着ALT下降(ALT:29.3U/L±13.4U/L)而迅速降至6.093±1.428(对数值)(图1)。9例(82%)患者高峰值是在最大肝损害之前或与ALT同时达到高峰，其中5例血清HBV DNA水平高峰值是在最大肝损害前出现，4例则与ALT同时达到高峰。余2例发病前中无明显变化，反而在恢复期有所上升。血清HBV DNA水平发作中，与发作前比较差异无显著性(P＞0.05);与发作后比较差异有显著性(P＜0.05)
2.2 2例反复发作的慢性乙型肝炎和1例肝炎后肝硬化患者的系列血清测定HBV DNA含量的变化。示例如下：
例1.胡××，男性，34岁。临床诊断：慢性乙型肝炎(中)。HBsAg(+)13年伴食欲下降、尿黄和肝功能异常4年。图2显示了患者自1996年7月、1997年12月2次急性发作前、中和后的血清HBV DNA和生化全貌。病程中，患者HBeAg持续阴性。
图1 11例慢性乙型肝炎急性发作前、中和后的血清HBV DNA水平变化
Fig.1 Levels of serum HBV DNA before, during and after
acute exacerbation in 11 patients with chronic hepatitis B
例2.吴××，男性，33岁。临床诊断：慢性乙型肝炎(中)。HBsAg(+)10年伴反复发作2年。图3显示了患者自1996年4月以及6月、1997年5月3次急性发作时的血清HBV DNA和生化全貌。病程中，显示了血清HBeAg和抗-HBe的转换。
例3.罗××，男性，48岁。该患者出现HBsAg(+)28年，并诊断为慢性乙型肝炎。自1997年3月以来，病情反复发作，半年前诊断为肝炎肝硬化(失代偿期)。我们观察了患者一年多来3次急性发作的情况。图4显示血清HBV DNA含量多持续在108～1010拷贝/亳升，表现持续高水平的病毒血症。该患者多次检测HBeAg均(+)。
2.3 5例献血员做为对照检测 全部献血员的血清HBV DNA含量均为阴性。
3 讨论
在慢性乙型肝炎的自然病程中，病情常反复活动。多数学者认为［8-14］HBV复制与肝病活动有关。例如，有活动性肝病的慢性乙型肝炎患者总是有病毒复制的证据，而病毒复制的增加通常与肝脏病变活动的急性加重有关，并且与肝脏炎症程度有关。但也有不同观点。Hsu等［15，16］提出：HBV的复制并不总是伴有肝损害，比如，在HBV感染早期免疫耐受阶段，尽管存在着活动性病毒的复制，肝组织却可以正常或接近正常。Khakoo等［17］报道，在许多高水平病毒血症的许多病人并没有血清ALT的升高。
我们对一组慢性乙型肝炎患者自发性急性发作前、中和后的血清HBV DNA含量及肝功能的测定，显示了慢性乙型肝炎的发作与HBV复制水平的关系十分密切。9例(84%)患者的血清HBV DNA含量的高峰值是在最大肝损害之前或与ALT同时达到高峰，然后随着ALT及其它肝功能指标的恢复而明显下降。这一结果与国外其他学者的研究结果相一致［1，8，9，18］。这提示机体对HBV的免疫反应是依赖HBV剂量的，免疫介导的肝细胞损伤需要一定的病毒阈值浓度。血清HBV病毒血症水平的增加触发了机体的免疫反应，结果导致了肝脏损害，表现为血清ALT增高等。HBV感染细胞是免疫反应的靶细胞［15］。
图2 患者胡××1996年7月以来血清HBV DNA和ALT水平的变化
Fig.2 The level of serum HBV DNA and ALT of the patient (HU Y C) with chronic hepatitis B since july, 1996
图3 患者吴××1996年4月以来血清HBV DNA和ALT水平的变化
Fig.3 The level of serum HBV DNA and ALT of the patient (WU SD) with chronic hepatitis B since April, 1996
图4 患者罗××1997年3月以来血清HBV DNA和ALT水平的变化
Fig.4 The level of serum HBV DNA and ALT of the patient (Luo WB) with liver cirrhosis since March, 1997
我们随访2例反复发作的慢性乙型肝炎病例，也观察到了相似的特点。该2例患者在发作中，均显示出血清HBV DNA的高峰值先于ALT高峰之前或与ALT同时达到最大值，并以此反复，表现出慢性乙型肝炎发作的特点：急性肝损害与正常肝功能交替进行的模式。Maruyama等［1］也已报告相似的结果。这一结果表明：病毒与机体的免疫反应之间的平衡不是静止的，而是动态和相互作用的。这一模式预见：在慢性乙型肝炎急性发作前，由于一些不甚明了的原因，肝脏内HBV复制增加，病毒抗原分泌和累计增加，当达到一定阈值水平即刺激机体产生免疫反应，导致肝细胞损伤。当病毒表达的肝细胞被清除时，HBV复制减少，病毒抗原下降到阈值以下，溶细胞的免疫反应减轻，肝脏炎症减轻。然后，病毒复制逐渐恢复。这一过程自身不断的重复或直到病毒被清除。
慢性乙型肝炎的发病机制是十分复杂的。在我们的研究中，有2例患者并没有向大多数的病例所显示的那种模式，其原因尚不清楚。而病毒含量的变化又受到诸多因素的影响，如机体免疫压力、病毒逃避宿主免疫、重叠其它病毒感染时的激活、免疫抑制剂的使用、疲劳及精神压力等多种影响。HBV含量的变化可能是病毒本身的因素，也可能是众多因素影响之后的结果。由此，HBV复制可能作为一个环节，使病毒抗原含量的相应增加，激发机体免疫损伤。
研究结果说明血清HBV DNA含量的变化与大多数慢性乙型肝炎的发作有着密切的关系。慢性肝病再发作，HBV的复制作为重要的因子，启动和激发了机体的免疫反应，导致了肝细胞的损伤。机体的免疫反应和肝细胞的溶解应是由一系列的体液和细胞介导的反应所决定的。血清和细胞中增加的病毒复制和病毒抗原的累计及继发的免疫反应在慢性乙型肝炎肝损害的急性发作中具有重要的作用。
本课题受卫生部优秀青年人才基金资助(基金编号97018)及美国中华医学基金课题资助
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