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A mutation specific polymerase chain reaction for detecting hepatitis B virus genome with A-to-C mutation at nt585
FANG Dexing, LI Faqing, TAN Weiguo, et al.
Huadong Research Institute for Medical Biotechnics, Nanjing 210002
【Abstract】 Objective To investigate the prevalence of hepatitis B virus (HBV) nt585 A-to-C mutants in China.Methods A mutation specific polymerase chain reaction (msPCR) was established for amplifying HBV DNAs with A-to-C mutation at nt585. Two sets of primer pairs with same sequences except for one base at 3′terminus were designed and synthesized according to 48 of the known HBV genome sequences and the popular HBV subtypes, adr and adw, in China.Results 57 of HBV S gene fragments amplified by a nested PCR from different and child adult hepatitis B patients were characterized by using the msPCR. It was shown that HBV mutants with A-to-C mutation at nt585 could be confirmed.Conclusion The msPCR is a specific and sensitive method for detecting the HBV nt585 A-to-C mutants.
【Key words】 Hepatitis B virus Mutation Polymerase chain reaction
乙型肝炎病毒(HBV)免疫逃避株是引起免疫失败的重要原因之一。80年代末以来，随着越来越多HBV免疫逃避株的出现，人们开始考虑是否在未来的乙型肝炎疫苗中使用变异抗原成分问题。因此，研究已知重要变异株的临床分布显得十分必要。而就此目的而言，最有潜力的方法是突变特异性聚合酶链反应(msPCR)［1］。我们曾分别在2例乙型肝炎免疫失败儿童患者体内发现HBV基因组nt585位A→C突变，导致乙型肝炎表面抗原(HBsAg)aa144位Asp→Ala替换的免疫逃避株［2］。为了进一步调查这种变异株在我国乙型肝炎患者中的分布，根据已知的48个HBV基因组序列，结合国内主要流行adr和adw亚型的特点，分别设计在HBV DNA nt585位碱基不同的2套4对引物，建立了检测该位点A→C突变的msPCR方法。通过对57个巢式PCR扩增的HBV S基因片段的检测证明了该法的特异性和敏感性。
1 材料和方法
1.1 HBV DNA样本 11个HBV S基因片段参考文献［2，3］，另14份乙型肝炎免疫失败儿童患者血清和32份成人患者血清(HBsAg-, 抗HBs+)同样经巢式PCR方法［3］获得HBV S基因片段。回收目的DNA，经电泳定量后稀释至30 pmol/L，冻存于-20℃，作为msPCR的模板DNA。
1.2 引物设计 根据载自美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的48个已知HBV基因组序列，结合国内主要流行adr和adw亚型的特点设计特异性寡核苷酸引物。
1.3 对照HBV DNA 含adr亚型HBV DNA的重组质粒pADR-1［4］由中国科学院上海生物化学研究所甘人宝教授惠赠，其nt585为A；以pADR-1 DNA为模板，经引入突变法获得nt585位为C的adr亚型对照DNA。重组噬菌体p16［2］，含adw亚型HBV S基因，其nt585为C。以p16DNA为模板，经引入突变法获得nt585位为A的adw亚型对照DNA。
1.4 msPCR扩增条件的优化 Tag DNA聚合酶和三磷酸脱氧核苷(dNTP)购自Promega公司。为了保证HBV DNA扩增特异性，参考文献［5］对影响PCR的因素(主要是退火温度)进行优化。
2 结果
2.1 寡核苷酸引物的序列与位置 分别针对adr和adw亚型HBV DNA设计了2套4对供msPCR扩增的寡核苷酸引物，其序列和位置如下。
P585RA：TTGCTGTACAAAACCTTCGGA，nt565-nt585, 上游引物；
P585RC：TTGCTGTACAAAACCTTCGGC，nt565-nt585, 上游引物；
P585WA：TTGCTGTACAAAACCTACGGA，nt565-nt585，上游引物；
P585WC：TTGCTGTACAAAACCTACGGC，nt565-nt585, 上游引物；
PP：GCTGCAGGTTTAAATGTATACCCAAAGAC，nt838-nt816, 下游引物；下划线部分为附加
的PstⅠ位点。
其中P585RA-PP、P585RC-PP引物对分别用于扩增adr亚型nt585A和nt585C序列；P585WA-PP、P585WC-PP引物对分别用于扩增adw亚型nt585A和nt585C序列。扩增DNA片段长度为280 bp。
此外，为了获得对照DNA，分别设计合成了引入突变的上游引物如下。
P585RCM：TTGCTGTACAAAACCTTCGGCCGGAA
AC，nt565-nt592;
P585WAM：TTGCTGTACAAAACCTACGGACGGAA
AC，nt565-nt592;
2.2 引入突变法获得对照DNA 参考文献［6］，采用常规程序，94℃/30 s，54℃/30 s，72℃/60 s，30个循环，进行PCR。分别以P 585RCM-PP引物对扩增p ADR-DNA获得了nt 585位为C的adr亚型对照DNA，以P 585WAM-PP引物对扩增p 16DNA获得了nt 585位为A的adw亚型对照DNA(图1)。
2.3 msPCR方法的建立 参考文献［5］并结合几对引物的碱基组成，首先采用68℃退火温度进行常规PCR，反应程序为：94℃/30 s，68℃/30 s，72℃/30 s，30个循环，结果见图2所示。除了P 585WA-PP对adw亚型对照DNA出现预期扩增结果外，其余引物均不同程度地存在假阳性现象，也就是将不相匹配的单克隆对照DNA扩增出来。因此分别对各引物的退火温度进一步优化。结果发现它们的最佳退火温度略有差异，其中P 585RA-PP为69℃，P 585RC-PP为71℃，P 585WC-PP为70℃。这一结果说明退火温度在msPCR中的重要作用。
图1 引入突变法扩增对照HBV DNA
Fig.1 PCR amplification of control HBV DNA
by primers with inner mutation
Lane 1: DNA marker, pBR322 DNA digested with Hinf I.Lane 2-3: adr subtype HBV DNA with a C at nt 585 amplified by P585RCM-PP and adw subtype HBV DNA with an A at nt 585 amplified by P585WAM-PP, respectively. The amplified DNA fragments are 280 bp long.
2.4 msPCR方法的初步验证 首先以回收的13个HBV S基因片段为模板，分别经P 585RA-PP、P 585RC-PP、P 585WA-PP和P 585WC-PP引物对进行msPCR扩增，结果见表1所示。
该结果与预期的存在差异，主要表现在已测定序列的#19(adr亚型，GenBank录入号码AF013631)［7］、#24(adr亚型，GenBank录入号码AF(036236待发表)、#30(adw亚型)(未发表资料)和TX(adr亚型，GenBank录入号码AF 052576)(待发表)。在分别用所谓的adr和adw特异性引物扩增时均出现阳性结果。也就是引物倒数第5个碱基不同(adr亚型为T，adw亚型为A，见方法1.2)时不会影响3′端碱基不同的msPCR的特异性扩增。反过来再利用adw亚型特异性引物对P 585WA-PP 和P 585WC-PP分别扩增4种对照DNA，结果证明了上述结论(表2)。因此可以考虑在实际临床检测中仅使用P 585WA和P 585WC。
图2 msPCR扩增对照HBV DNA
Fig.2 Amplification of standard HBV DNA by msPCR
Lane 1: DNA marker, pBR322 DNA digested with Hinf I. Lane 2-3：P585RA-PP amplified HBV DNAs of adr subtype (nt585A in Lane 2 and nt 585C in Lane 3). Lane 4-5: P585RC-PP amplified HBV DNAs of adr subtype (nt 585A in Lane 4 and nt 585C in Lane 5).Lane 6-7: P585WA-PP amplified HBV DNAs of adw subtype (nt 585A in Lane 6 and nt 585C in Lane 7). Lane 8-9: P585WC-PP amplified HBV DNAs of adw subtype (nt 585A in Lane 8 and nt 585C in Lane 9).
2.5 msPCR方法的初步应用 利用上述结果所优化的msPCR条件，分别以P 585WA-PP和P 585WC-PP引物对检测由乙型肝炎免疫失败患者血清扩增的HBV S基因片段(其中儿童样本14份，成人样本32份)，结果发现分别有1例儿童样本和1例成人样本呈现nt 585C阳性，2例成人样本nt 585A和nt 585C皆为阴性，余者呈nt 585A阳性(表3)。
3 讨论
突变特异性PCR(msPCR)，也称等位点特异性PCR(allele specific polymerase chain reaction, asPCR)，曾被成功地用于检测镰刀型红细胞贫血患者β-珠蛋白等位基因点突变［8］以及HIV-1的突变研究［9］，并已被用于检测HBV前C/C变异株［6，10］。考虑到所用的引物仅相差一个碱基(尽管是在3′端)，退火温度是影响反应特异性的最关键因素之一。在对msPCR条件优化中，发现不同引物的退火温度略有差异，适当改变退火温度可完全消除非特异性扩增。这与先前报道的HBV nt 531位msPCR有所不同，后者在直至退火温度达73℃而改为双温控PCR时仍不能消除非特异性扩增现象；需要进一步优化其它条件(包括适当降低Tag DNA 聚合酶浓度和引物浓度等)才能获得正确结果［5］。这说明了不同引物的碱基组成对PCR特异性扩增的影响。
我们的研究在分析已知HBV DNA序列的基础上，考虑到了我国目前主要流行adr和adw亚型HBV的特点。鉴于adr与adw亚型在所设计的引物区内(nt 565-nt 585)除目标突变(位于3′端)外还相差1个碱基，合成了2套4对引物。实际检测中发现，这个在被检DNA上相当于引物倒数第5位的碱基不会影响msPCR特异性扩增。通过利用单克隆对照DNA进一步试验，证明使用2对引物可以保证绝大多数nt 585位A或C的HBV DNA的正确扩增，尽管已知的ayr和ayw亚型HBV在该引物位置还存在其它点突变。由于该区域恰与HBsAg中和性抗原决定簇α编码区重迭，对于上述两引物扩增均为阴性的HBV DNA，可能预示着有意义的突变，值得进一步经核苷酸序列分析鉴定。本方法的建立为调查nt 585位A→C变异株的流行分布提供了可靠的手段。
表1 nt 585位突变特异性聚合酶链反应对13个HBV S基因片段的扩增*
Tab.1 Characterization of 13 of HBV S gene fragments by msPCR for nt585*| 引物对
Primer pairs |
不同的HBV S基因片段(HBV S gene fragments from different patients) | ||||||||||||
| #16 | #18 | #19 | #20 | #23 | #24 | #26 | #27 | #29 | #30 | #105 | NW | TX | |
| P585RA-PP | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| P585RC-PP | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - |
| P585WA-PP | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| P585WC-PP | + | - | - | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - |
*所有HBV S基因片段均为巢式聚合酶链反应获得，其中16、18、19、20、23、24、26、27、29和30号参考文献［3］，105号参考文献［2］，NW和TX分别来自2个乙型肝炎免疫失败儿童患者。
*All of the HBV S gene fragments were amplified by a nested polymerase chain reaction. The detailed information of fragments #16, #18, #19, #20, #23, #24,#26, #27, #29, #30 were in referene［3］, and that of fragment #105 was in reference［2］. the NW and TX were from 2 child patients of hepatitis B immune failure, both of the sera were negative for HBsAg and positive for anti-HBs.
表2 P585WA和P585WC对4种对照DNA的突变特异性聚合酶链反应*
Tab.2 Amplification of different control DNAs by msPCRwith primers P585WA and P585WC*
| 引物对
Primer pairs |
不同亚型的HBV DNA
HBV DNAs of different subtypes | |||
| adr(nt585A) | adr(nt585C) | adw(nt585A) | adw(585C) | |
| P585WA-PP | + | - | + | - |
| P585WC-PP | - | + | - | + |
*adr亚型与adw亚型HBV DNA在与引物倒数第5个碱基配对的位置不同,该引物组成上的差异不影响突变特异性聚合酶链反应扩增。
*The DNA sequences of adr subtypes are different from those of adw subtypes at the nucleotide position complementary to fifth base from the 3′end of the primers. this difference of base composition did not interfere with the PCR amplification.
表3 HBV nt 585位突变特异性聚合酶链反应的应用
Tab.3 Application of the msPCR for detecting mutation
at nt 585 of HBV
| 引物对
Primer pairs |
儿童样本
Child samples |
成人样本
Adult samples |
| nt585A | 13/14 | 29/32 |
| nt585C | 1/14 | 1/32 |
| non-nt585A,non-nt585C | 0/14 | 2/32 |
本课题受江苏省自然科学基金资助(编号BK97188)
参考文献
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