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材料与方法
表达载体的构建、纯化及测序：通过PCR方法扩增全长HBV Adr亚型preS基因, 从本所克隆的HCV E2蛋白基因的真核表达载体pCMVE2上扩增HCV E2基因。将preS和E2蛋白基因克隆到真核表达载体(pcDNA3)上。通过酶切鉴定获得含有HBV preS和HCV E2蛋白的嵌合基因的阳性克隆。用聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA。DNA测序由赛百盛公司完成。
HCV E2和HBV preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达：用DOTAP脂质体转染剂（购自宝丽曼公司）将质粒DNA转染细胞6小时，换新鲜培养液继续培养48小时，用胰酶消化、PBS洗涤后制成细胞悬液，并制成细胞滴片。细胞先后与preS2单抗和FITC标记的羊抗鼠IgG孵育后，在荧光显微镜下观察有否融合蛋白的表达。同时以不加preS2单抗为阴性对照。
质粒DNA免疫BALB/c小鼠：用质粒pcDNA3(空载体)、pCMVE2(pcDNA3上只含HCV E2基因)、pCMVpreS-E2（质粒含HBV preS- E2嵌合基因，preS基因位于E2基因之前）和pCMVE2-preS(E2基因位于preS基因之前)免疫6～8周龄雄性BALB/c小鼠，分别免疫6、8、8、8只。每只小鼠在尾根部1cm处皮下注射质粒DNA 50μg，初次免疫后1周，在相同部位注射质粒DNA 50μg加强免疫一次。在初次免疫后，分别于第2、4、6、8、10、12和22周从尾静脉采血，按常规分离和冻存血清，准备用于检测HCV E2抗体。
免疫小鼠血清HCV E2抗体的检测：以纯化的在大肠杆菌表达的HCV E2蛋白包被酶标板，经ELISA方法检测基因接种小鼠产生的E2抗体，以接种空载体的小鼠血清为阴性对照，以大于阴性对照平均吸光度(A)值加两个标准差为阳性判断标准。
结果与讨论
所扩增的HBV preS基因约为520 bp，HCV E2蛋白基因约为1.1 kb，DNA测序表明，读码框架正确。E2和preS融合蛋白表达载体的构建见图1。免疫荧光检测显示，转染了表达载体的COS7细胞可表达preS2抗原，表明表达载体能在哺乳动物细胞中表达preS-E2融合蛋白。
图1 pCMVE2、pCMVpreS-E2和pCMVE2-preS表达载体(质粒)的构建
DNA免疫可以致敏MHC I和MHC II型细胞，可以诱导更广泛的免疫应答，皮下注射免疫效果比肌肉注射更好〔3〕。我们采用了尾根部皮下注射质粒进行小鼠基因免疫。用纯化的原核表达的HCV E2蛋白对各免疫小鼠各稀释度血清进行E2抗体的检测，结果显示（见表1），在pCMVE2质粒接种组，在22周之前，未见小鼠产生抗E2抗体（滴度大于1∶25），在22周只有2例的抗体为1∶25。而Tedeschi用含HCV E2基因的质粒经肌肉注射免疫12只小鼠，在第二周有10只产生了抗E2抗体〔4〕。检出结果与报道有差异，其原因可能有：1）所用表达载体的不同，故而E2蛋白的表达量有差异。2）检测抗E2抗体所用试剂不同。我们所用抗原为原核表达的无糖基化的E2抗原，此抗原的抗原性较低，从而使检出率降低。还有可能pCMVE2免疫小鼠抗体的滴度在1∶25以下在血清稀释1∶25倍以上时不能检出。
表1 pCMVE2、PCMVpreS-E2和pCMVE2-preS接种小鼠抗HCV E2的检测
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免疫周数 | |||||||||||||||
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2 |
4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 22 | |||||||||
| 质粒 | 例 | 例 | 滴度 | 例 | 滴度 | 例 | 滴度 | 例 | 滴度 | 例 | 滴度 | 例 | 滴度 | 例 | 滴度 |
| pCMVE2 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 1：25 | ||||||
| pCMVpreS-E2 | 8 | 6 | 1：25～1：200 | 6 | 1：25～1：500 | 6 | 1：50～1：500 | 7 | 1：50～1：400 | 8 | 1：50～1：300 | 6 | 1：50～1：300 | 6 | 1：50～1：200 |
| pCMVE2-preS | 8 | 2 | 1：50 | 3 | 1：100～1：200 | 3 | 1：25～1：200 | 3 | 1：25～1：150 | 3 | 1：25～1：150 | 4 | 1：25～1：200 | 6 | 1：25～1：200 |
为研究HBV preS和HCV E2融合蛋白中preS对E2蛋白免疫原性的调节作用，我们用含有preS-E2嵌合基因的质粒pCMVpreS-E2接种了8只小鼠。结果显示，在免疫的第二周，有6只产生了E2抗体，抗体滴度达1∶200，第4、6周滴度上升到1∶500，第10周时所有小鼠均产生了E2抗体，其免疫效果明显高于单独E2基因的免疫效果。在含有E2-preS嵌合基因的质粒pCMVE2-preS接种的8只小鼠中，第二周有2只产生E2抗体，滴度为1∶50，第4、6周产生抗体的例数有所增加(3只)，抗体滴度也升高到1∶200，至22周，产生E2抗体的例数为6只，其免疫效果也优于单独E2基因的免疫效果。结果表明，融合蛋白中preS增加了E2蛋白的免疫原性。其原因可能为preS为E2蛋白提供了附加的T细胞和B细胞表位，克服了单元型限制性反应〔5〕，从而增加了E2抗体的产生。Major在研究HCV C蛋白的基因免疫也发现，当载体只含有HCV C蛋白基因时，免疫小鼠不产生C蛋白抗体，而与preS嵌合时就能产生C蛋白抗体〔5〕。
pCMVpreS-E2接种组，不论在产生E2抗体小鼠的数量上，还是E2抗体的滴度上均高于pCMVE2-preS接种组。而两接种基因之间唯一区别只在于preS基因的位置不同。pCMVpreS-E2免疫效果优于pCMVE2-preS的原因可能的解释为：1) preS为较容易表达的基因，preS位于E2之前，使E2的表达量有所增加。2) preS位置不同，影响了E2蛋白的折叠或糖基化。3) preS位置不同，改变了E2蛋白的呈递方式。具体机制有待进一步研究。融合蛋白中preS对E2蛋白免疫原性的增加有可能成为研制慢性丙型肝炎治疗性疫苗的突破口。本结果也提示，在构建融合蛋白时，为使蛋白有更好的免疫原性，应考虑蛋白之间的位置关系。
编者评注：本文证明HBV preS对HCV E2蛋白有增强其抗原性的作用，在构建的质粒中preS的位置在E2基因的5或3有显著差别，这些结果对研究基因苗十分有用。由于本文为初步结果，试验动物数较少，故以短文发表，以便同行们早日了解这方面的研究进展。希望作者进一步研究pCMV E2在细胞中成功表达的一些数据以及动物产生的抗体是否为保护性抗体等，使本课题的结果日臻完善。参考文献
1 Choo QL, Kuo R, Ralston A. Vaccination of chimpanzees against infection by the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA，1994, 91∶1294-1298.
2 Shouval D, Ilan Y, Adler R. Improved immunogenicity in mice of a mammalian cell-derived recombinant hepatitis B vaccine containing pre-S1 and pre-S2 antigens as compared with conventional yeast-derived vaccines.Vaccine，1994, 12∶1453-1459.
3 Raz E, Carson DA, Parker SE. Intradermal gene immunization: The possible role of DNA uptake in the induction of cellular immunity to viruses. Proc Natl Acad Sci USA，1994, 91∶9519-9523.
4 Tedeschi V, Akatsuka T, Shih JWK. A specific antibody response to HCV E2 elicited in mice by intramuscular inoculation of plasmid DNA containing coding sequences for E2. Hepatology，1997, 25∶459-462.
5 Major ME, Vitvitski L, Mink MA. DNA-based immunization with chimeric vectors for the induction of immune responses