丙型肝炎病毒(HCV)是引起输血后非甲非乙型肝炎(NANBH)主要病原体，是一种全球性传染，给人类健康带来极大的危害.据统计，丙型肝炎患者中约60%转为慢性肝炎，其中又有20%的病人转为
肝硬化或肝细胞癌.而目前在预防和治疗HCV感染上还没有有效的方法.因此，及时准确地诊断HCV感染是极其必要的.
一、丙型肝炎流行病学概况及主要
临床表现
NANBH分为肠道传播和肠道外传播两类.1987年11月，WHO病毒肝炎技术咨询小组建议将其分为两类，一类称为肠道传播的非甲非乙型肝炎(Enterically，Transmitted Non-A、Non-B Hepatitis)，简称ET-NANBH，该类型肝炎的病原体为HEV;另一类称肠道外传播的非甲非乙型肝炎(Parenterally Transmitted Non-A、Non-B Hepatitis).简称PT-NANBH.即丙型肝炎，该类型肝炎的病原体为HCV.
(一)HCV与输血后NANBH
输血后肝炎，约90%为
丙肝，故输血是丙肝重要的传播途径.美国报告商品供血者，发生丙肝达38.5%，比志愿
献血者高5～10倍，输血量越多，发病率越高.据报告各国志愿输血人群的HCV携带率:日本为30.4%、瑞典为18.9%、美国为6.4～14.6%、意大利为17.8%.
(二)HCV与散发性NANBH
丙型肝炎除输血传播外，还有散发性病例.散发性病例占该型肝炎的比例在日本为45%、美国为20-40%、意大利为18%、瑞典和英国为13%.
(三)健康人群中抗HCV的阳性率
研究报告指出，在健康献血员中，各国的抗-HCV阳性率差别较大，总的来讲，非洲〉亚洲〉欧洲〉美洲.有统计数字表明，非洲某些国家的抗-HCV阳性率为6%，在日本为1.5%，泰国为2.0%.
(四)HCV与肝细胞癌(HCC)
据调查，在日本的HCC病因学中，HCV的重要性较HBV高4倍.用PCR在乙型肝炎标志为阴性的
肝癌组织和周围的硬变组织中均可查到HCVRNA.在一些欧洲国家许多HCC与
乙肝无关，用PCR检测不到HBVDNA，但可查到HCVRNA，预示大多数HCC病例由HCV所致.
(五)丙肝的临床表现
丙型肝炎一般症状较轻，发热少见，潜伏期平均7.4周而且存在着大量的隐性感染，隐性感染者的ALT正常，但有持续性病毒血症，有传染性.估计有HCV传染性的供血员，约70%表现为ALT正常.丙型肝炎易转为慢性，并且容易最终导致肝硬化和肝细胞癌.日本报告50%的急性丙型肝炎患者可慢性化，慢性肝炎的60-70%为丙肝，肝癌及肝硬化的85%与HCV有关，美国曾报告丙肝患者病后6个月ALT仍不正常约占57%.
二、HCV的分子生物学进展
1.HCV为直径约为55-65nm的球状颗粒，表面带有6nm的刺状突起，中央为一个30-35nm的核壳体，外膜含有脂类，对热和有机物溶剂敏感，最低的沉降系数为140S，蔗糖梯度浮力密度为1.14-1.16g/ml.易感动物为黑猩猩.属黄病毒科.目前，对HCV的基因结构已有了较详细的认识，HCV是单股正链RNA病毒，目前到少报道了16株HCV的全基因序列，由于基因型不同，从各地分离的HCV基因组长度也不一致，一般为9400-10000b以之间.在HCV基因组5'和3'端分别为非编码区(UTR);中央部分为一个大的开放阅读码框架(ORF)，可分为结构区和非结构区，前者又分为核心蛋白基因区(C区)，和衣壳蛋白的基因区(E区);后者又分为NS1/E2、NS2、NS3、NS4、NS5等五个非结构蛋白基因区。
1）.非编码区:HCVRNA5'端和3'端各有一段不编码蛋白的序列，称为非编码区.①5'非编码区:全长332核苷酸.该区是HCV基因组中最保守的区域，在不同病毒分离株之间，最多仅有8%nt发生改变.该区还存在着重复序列CACTCC，在各基因型间是不变的，提示该区在病毒复制过程中，或许还在翻译水平上可能起着非常重要的作用.Brown根据RNase酶切分析，推测在5'端有4个区段(Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区、Ⅳ区)可以形成茎环结构(Stem-loop Structure)并含有一个Pyrimidine丰富区，提示有一个核蛋白结合位点(an internal ribosome entry site，IRES)存在.并推测HCVRNA的翻译是由核蛋白与IRES的结合来启动的，该区存在的二级结构是HCVRNA复制和翻译不可少的.②3'端非编码区:位于ORF下游，是HCVRNA中变异性最大的区域.其有一个聚Poly(U)片段尾，此结构是HCV所独有的，它们可能与基因复制有关.3'非编码区的碱基序列及长度，随不同的分离株而差异较大，一般长度在27-55nt.这一区域在HCV的复制过程中所起的作用，还有待进一步研究.
2）.结构区:该区位于大的开放阅读框架前部，全长1167nt.又分为核心蛋白基因区、外膜蛋白基因区.①核心蛋白基因区(C区):Okamoto认为该基因区位于HCV-RNA基因组的第1-191位密码子区(333-906nt)，编码一个含191个氨基酸残基的蛋白，主要构成HCV的核心颗粒，故称该区为核心蛋白基因区.该基因区是HCVRNA读码框架中最保守的区域，保守程度紧次于5'非编码区，其合成的核蛋白中，仅有2-8(1.0-9.4%)个氨基酸发生改变，而且在其氨基酸序列中，至少有二个高保守的亲水区，是稳定的抗原决定簇，按其序列合成的多肽CP10和CP9具有很好的免疫原性，相应抗体出现早，亲合力强.因此该基因区是研究HCV免疫学试剂的重点区段.Takamizawa曾把核心蛋白基因分成两个部分，即将1-114位密码子区为“核心蛋白基因”，115-191位密码子为“基质蛋白基因”.他认为“核心蛋白基因”编码一个含114个氨基酸，分子量约为13KDa，其中含有高比例(23.5%)的精氨酸和赖氨酸，因此有较强的亲水性，可能与核心蛋白易和HCVRNA基因组结合有关.“基质蛋白基因”又称M基因，主要依据黄病毒的RNA基因结构推测得出，其编码一个由77个氨基酸组成的多肽，有较强的疏水性.由于这一蛋白是否存在尚不肯定，故现在的文章中已不再提M基因.②外膜蛋白基因区(E区):该基区位于核心蛋白基因之后，在HCVRNA基因组的第192-389位密码子区(907-1499nt)编码一个含有198个氨基酸残基的蛋白.该蛋白分子量为21.4KDa，主要构成HCV外膜，故称该基因为外膜蛋白基因，外膜蛋白的羟基端(C端)有较强的疏水性，可能有利于同宿主细胞膜结合.另外，该蛋白还含有数个糖基化位点.E1基因序列有较大的变异性，这反映在E1膜蛋白的抗原性的高变性，有利于逃避机体免疫系统的攻击.但该区域也存在相对稳定的区域.Ray等曾对E1糖蛋白的两个抗原决定簇P1(第210-223密码子区)和P2(第315-327密码子区)的抗原性进行比较，发现P2处于高保守区，有比较稳定的抗原性，是研制HCV免疫学试剂可以利用的区段.
3）.非结构蛋白基因区:该区编码的蛋白不是病毒颗粒的构建成份，它主要与病毒的复制有关，它们分别是NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b，等7种蛋白，是由非结构前体蛋白经病毒本身产生的蛋白酶切割与修饰而形成的.NS1位于HCVRNA的第390～729(1450-1519nt)位密码子区，有的学者认为NS1应属结构区基因，与E1共同编码HCV外膜糖蛋白，故也称为E2，现在文献中多写成NS1/E2.该段基因编码一个含340个氨基酸的蛋白，分子为38KDa，NS1/E2区和E1一样，具有较大的变异性，根据NS1/E2碱基序列的同源性可将HCV分为2个类型，即HCV1和HCV2.HCV1型在NS1/E2外膜糖蛋白gP72的氨基端有一段长约26个氨基酸的区段(386-411位密码子区)是一个超变区(HVR1);而在HCV2型中，除了存在HVR1区外，还有一个高变区HVR2，位于474-480位密码子之间.HCV所有分离株在HVR的序列均不相同，且HVR1比HVR2更易变异.Kato等于不同时间连续地对2例慢性丙型肝炎病人HCV的HVR1和HVR2序列变异率分析发现，HVR1平均每月有一个氨基酸改变.这些超变区在HCV生物学上的真正意义还不清楚，但可推测它们的存在与HCV容易逃避机体免疫系统的“监控”有很大关系.NS2位HCVRNA基因组的第730-1006位密码子区(1520～3350nt).编码一个含有277个氨基酸的蛋白，该蛋白含有较多的疏水氨基酸.因此具有较强的疏水性，其功能可能与膜结合作用有关.NS3位于HCVRNA基因组的第1007-1615位密码子区(3351-5177nt)，编码一个含60个氨基酸的蛋白，该区变异性较小，与RNA解旋酶的表达有关.NS3蛋白含有较强的优势抗原表达区，不仅没有型特异性，而且相应的抗体出现较早，反应性也较强.因此NS3抗原和C抗原一样，是第二代抗HCV诊断试剂的必需抗原成份.NS4位HCVRNA基因组1616-2013位密码子区(5178-6371nt)，编码一个由398个氨基酸组成的蛋白，经水解成为两个蛋白:NS4a(1616-1862)和NS4b(1863-2013).该区编码的蛋白有较好疏水性，可能与膜结合有关.NS5位于HCVRNA基因组的2014-3010位密码子区(6372-9362nt)，编码一个含997个氨基酸残基的蛋白，该区有较高的保守性，是依赖于RNA的RNA聚合酶基因区，与病毒复制有关.通过真核表达和体外翻译系统表明:NS5区至少裂解为两个蛋白，它们是NS5a区的56KD蛋白和NS5b区的66KD蛋白，前者溶于水，后者不溶于水.保守的氨基酸序列GDDRNA聚合酶区就位于66KD的NS5，56KD的NS5b区还在病毒的复制中起作用，可能是复制复合物的成份.NS5a还可能与NS4b和NS5a之间的裂解有关.经核苷酸和氨基酸序列分析发现:NS5区存在B细胞和T细胞抗原决定簇表位.
2.RT-PCR检测HCVRNA的引物设计.从HCV的基因结构上可以看出，HCVRNA中各个区域碱基序列的保守程度不同，其保守程度由高到低依次为:5'UTR区>C区>NS3区>NS4区、NS5区>NS2区>NS1/E2、E1>3'UTR区.要对HCVRNA进行RT-PCR扩增其引物应选择在保守性高的区段，这样才能获得较高的检测率.因此，在进行RT-PCR检测时，引物大多选在保守性最高的5'-UTR区.西班牙的Castillo曾对各区的引物进行了比较，结果检测率分别为:5'-UTR为90%;C区为20%;NS3为80%;NS3/NS4为60%，NS560%.这一结果基本符合各区的碱基序列的保守程度的排列顺序，例外的是C区引物，它的检测率只有20%.原因在于C区虽然保守，但仍存在变异性较大的序列，而这个C区的反义链引物(用于反转录和PCR)正处在这种序列上，其中8/18个碱基在不同毒株间是不同的.由此提示我们选用5'-UTR区进行HCVRNA的RT-PCR扩增是最好的，另外还应注意的是引物不仅要设计在保守性高的区域，而且要处在保守的序列上.同时还应避开可能存在的茎环结构区.
三、病原体检测现状
由于HCV体积很小(直径约55-65mm)，在血液中的含量较低(平均约104COP./ml).另外，体外培养HCV目前尚未取得成功，因此直接进行HCV病原体的检测还没有一个成功的方法.目前进行HCV检测的方法主要是用免疫学方法和PCR法.
免疫学方法:
该方法主要是利用分子生物学技术获得的HCV重组抗原，来检测相应的抗体(ELISA实验).目前所用的ELISA试剂中采用了多重HCV抗原，主要有C区的C22、CP9，NS3区的C33-C，NS3/NS4区的C100-3等抗原，虽然比由C100-3单个抗原组成的第一代ELISA试剂的检测率有了提高，但仍然存在着缺点;①从HCV感染到血液中出现HCV抗体平均有22周时间的窗口期，在这个时期内，无法检测HCV抗体;②有些持续性HCV感染者可能不产生HCV抗体或产生的很少以致血清学方法无法检测;③HCV抗体的检测结果不能准确反映感染的程度.因此，需要更为直接，灵敏，准确的检测方法.
RT-PCR方法:
该方法是将病毒特定的核酸片段反转录合成cDNA，然后将cDNA进行PCR扩增.RT-PCR技术由于能直接扩增HCV的部分基因片段，使极少量病毒RNA的特定片段成百万倍地增加，便于检测因而是一种直接、敏感的检测方法.RT-PCR的反转录过程是在反转录酶的作用下，在37-42℃进行，这一步由于温度较低，容易造成非特异产物，使后面的PCR扩增带较宽甚至于“辅地毯”，使结果难以确定.解决这一问题的办法是再次扩增①用相同的引物②用第一次PCR引物的内侧引物，形成双PCR或巢式PCR，这样可以提高PCR的诊断效率.目前较多地使用巢式PCR进行扩增.从上面可以看出，从反转录到PCR以及再次扩增是一个较麻烦的过程，实验成本高、周期长.另外由于环节多增加了污染的机会.我们采用耐热反转录酶，在较高的温度下(62-65℃)进行反转录合成cDNA，这样就可以大大减少非特异cDNA的生成，使HCV及其它RNA病毒的PCR检测变得简便易行.
四、RT-PCR检测HCV急需解决的问题和研究方向.
随着对HCV感染的深入研究，以往的PCR仅定性检测HCV感染，已远远不能满足临床的需要，要研究HCV的传染性、疾病的发生、发展以及HCV对药物治疗的敏感性，就需要进一步定量测定血液或某些组织中的病毒含量.目前，RT-PCR还不能进行HCV的完全定量，目前研究仍处在半定量的水平上.因此，建立定量RT-PCR分析，具有重大意义.另外，由于RNA易降解，同时HCV在感染者的血液中含量较少，因此在RT-PCR扩增之前提取HCVRNA到目前为止仍是制约RT-PCR检测灵敏度和检出率提高的主要因素，因此一种简便、快速、大量地提取HCVRNA的方法，将大大推动RT-PCR检测HCVRNA以及其它RNA病毒常规化的步伐.流行病调查显示，丙型肝炎患者的慢性化，肝硬化和肝癌转变率明显高于乙型肝炎，提示HCV在人肝细胞内有其特殊的致病过程.RT-PCR技术为这方面研究提供了新方法.
目前，RT-PCR只能定性地诊断HCV，在这一历史时期，如何根据其结果准确地对临床症状进行评估，如干扰素对丙型肝炎的治疗效果的评估.这对临床开展RT-PCR检测HCV以及其它RNA病毒有着重要的指导意义.总上所述，目前进一步深入研究的课题及方向主要有:
①定量RT-PCR方法的研究.
②RT-PCR扩增方法的研究
③HCVRNA简便快速、高效的提取方法的研究.
④HCV感染在肝炎慢性化中的机理研究.
⑤HCV感染与HCC的关系和机理研究.
作者：
未知 2009-2-21