不同pH包被液对丙型肝炎病毒抗原反应性的影响

　　一、材料和方法

　　1.合成多肽和重组融合抗原：从HCV基因编码蛋白中，选择了已证明具有较强抗原反应性的4个亲水性较强的片段，用化学合成法合成了不同长度HCV核心区蛋白（CP9）、CP10、CP70；非结构区多肽抗原（511）。利用基因工程重组技术表达了HCV核心区和非结构区3（C-NS3）融合的优势抗原^［1，2］。

　　2.质控样品：从献血员中筛选血清，经确认，为抗HCV结构区和非结构区的抗体阳性8份、阴性10份。

　　3.包被液配制：0.05 mol/L醋酸缓冲液(pH2.0)；0.05 mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.0)；0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)；0.05 mol/L碳酸缓冲液(pH9.6)。

　　4.包被和酶联免疫吸附测定（ELISA）及数据处理：将合成多肽和重组表达的HCV抗原分别用上述4种不同pH包被液稀释（合成多肽抗原的包被浓度为4 mg/L，重组表达的HCV抗原为2.5 mg/L），4℃ 包被过夜，以0.2%牛血清白蛋白（BSA）封闭2小时。ELISA测定及数据处理：根据阴性血清测定平均值，以计算临界值（Cutoff），用阳性血清测定平均值除以Cutoff值（P/C）,计算P/C比值。

　　二、结果

　　1.不同HCV抗原在上述相同的抗原浓度下，用不同pH包被液稀释后用相同的工艺包被，同样的酶标抗体及固定的ELISA测定方法，对抗HCV阴、阳性血清进行检测，以阴性血清结果计算Cutoff值，观察不同抗原对8份阳性血清的检出率，发现不同pH包被液对检出率有不同程度的影响。除511抗原外，其他抗原的检出率均受包被液pH的影响。其中小分子多肽抗原CP9、CP10和 CP70，在低pH时检出率均较低，而重组抗原CNS3则以pH 2.0为最好，在pH9.6时也有较高的检出率。

　　2.抗原分别用4种不同pH包被液包板后，对内质控参比品测定P/C比值也不相同，如能够得到最高的测定P/C比值作为最佳包被pH,则抗原CP9、 CP10、CP70、511和CNS3的最佳包被液的pH值应分别为pH5.0、9.6、7.2、5.0和2.0。

　　三、讨论

　　众所周知，许多因素都可能影响蛋白质抗原的吸附而影响测定结果^［3］：如酶联板的预处理，包被温度、时间的选定，抗原的纯度和浓度等均可影响检测活性。包被液pH值的选择，一般多采用pH9.6的碳酸盐缓冲液。我们在平时实验中发现不同pH的包被液对HCV抗体的检出率也有很大影响。这次研究的结果进一步验证了包被液pH值选择的重要性。从结果来看，不同的抗原片段，包被液最佳pH值是不相同的。分析原因可能和多肽与蛋白质在不同pH环境中所带电荷不同，可影响抗原的包被量；另外，在不同pH环境中蛋白质抗原的折叠状态不同，抗原表位的暴露程度也不一样，这也可影响抗原的反应活性。这种推测是否也适用于其他蛋白质抗原，还有待进一步实验探索。

　　参考文献

　　[1]　郑怀竞，主编.临床检验ELISA指南.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1994.23-30.

　　[2]　孙柯儿，宋晓国，王国华，等.不同HCV优势抗原嵌合基因在大肠杆菌中的表达及其产物的分析.军事医学科学院院刊，1998，22：171-173.

　　[3]　李振甲，综述.酶免疫分析技术研究进展.标记免疫分析与临床，1998，5：215-219.

　　本课题受国家九五科技攻关项目资助(编号：969060306)