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关键词：肝炎病毒 丙型 感染指标 序列变异
为了研究结合病毒基因组序列的变化探讨动态检测抗-HCV-IgG、IgM及HCV rNA的临床意义及其间的相互关系，我们选择了HCV感染率相对较高的血液透析人群作为研究对象。在1995年3月对一批长期、多次进行血液透析的患者进行了筛选，确定了6例HCV感染者作为追踪对象，在随后1年半的时间里，对这些患者进行了随访，对其血清中HCV感染指标(抗-HCV-IgG、IgM、HCV rNA)以及HCV E2/NS1区的cDNA序列进行了动态观察，以了解HCV的感染及变异情况，探讨相应的临床意义。
材料与方法
一、血清标本
6例血液透析患者(编号1～6)血清由上海医科大学附属中山医院血液透析中心提供，其中男性3例，女性3例，年龄25～41岁，平均33岁。
二、抗-HCV-IgG检测
试剂盒为上海长征公司产品，操作按试剂盒说明书进行。
三、抗-HCV-IgM检测
试剂盒由第二军医大学微生物教研室生产(4°C以下稳定半年)，操作按试剂盒说明书进行。
四、HCV RNA的提取
用异硫氰酸胍酚氯仿法［1］。
五、HCV RNA的逆转录-套式-聚合酶链反应(RT-Nested-PCR)检测
采用RT-Nested-PCR进行检测。寡核苷酸引物根据中国人HCV基因组序列设计［2］，由复旦大学合成。外引物1:5′CTACTCCGGATCCCAC aAGC3′(核苷酸位置1009-1028)；外引物2：5′GGGCTCGGAGTGAAGCAATA3′(核苷酸位置1519-1538)；内引物1：5′ATTCCATGGTGG gGAACTGG3′(核苷酸位置10851104)；内引物2：5′GCAATACACTGGACCACACA3′(核苷酸位置15041523)。HCV cDNA的合成：将提取的RNA溶于20μl逆转录反应混合液中，内含5×逆转录反应缓冲液4μl，0.1mol/L dTT 2μl， 10pmol外引物2 1μl，10mmol/L dNTP各1μl，70°C 5分钟后，加入1μl100U鼠源逆转录酶(MMLV)及石蜡油2滴，于37°C反应1小时，95°C变性5分钟，冷却。HCV cDNA的扩增：第1轮PCR反应总体积50μl，含20μl逆转录反应产物及30μl反应扩增液，内含10×反应缓冲液5μl，15mmol/L mgCl2 5μl，10pmol外引物11μl,Taq DNA酶合酶1U，于DNA扩增仪上按94°C1分钟，54°C1.5分钟，72°C分钟行35个循环。第2轮PCR反应总体积55μl，内含5μl第1轮PCR反应产物及10×反应缓冲液5μl，15mmol/L mgCl25μl，10pmol内引物1和内引物2各1μl，10mmol/L dNTP各1μl及Taq dNA聚合酶1U，加入石蜡油2滴，按94°C 1分钟，60°C 1分钟，72°C2分钟的条件行35个循环。结果观察：取15μl第2轮PCR扩增产物在2%琼脂糖凝糖胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外检测仪上观察DNA带。
六、DNA序列测定
将第2轮PCR产物在0.7%低熔点琼脂糖凝胶中电泳，回收DNA，引物5′端的γ32PATP标记及测序反应均按操作说明书进行。
结果
一、6例血液透析患者血清抗-HCV-IgG、IgM、HCV rNA动态检测结果
动态观察6例血液透析患者血清抗HCV-IgG、IgM、HCV RNA检测结果如下：病例1：共收集血清6次，抗HCVIgG、IgM检测均为阴性，HCV rNA5次阳性(1995年3、10、1996年1、4、6月)；病例2：共收集血清3次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗HCVIgM检测均为阴性，HCV rNA均为阳性；病例3：共收集血清6次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗-HCV-IgM检测1次阳性(1995年3月)，HCV rNA3次阳性(1995年3月、1996年1、6月)；病例4：共收集血清6次，抗HCVIgG、IgM检测均为阳性，HCV rNA 4次阳性(1995年3月，1996年1、4、6月)；病例5：共收集血清6次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗HCVIgM检测2次阳性(1995年3月及1996年1月)，HCV rNA3次阳性(1995年3月、1996年1月、6月)；病例6：共收集血清5次，抗HCVIgG检测均为阳性，抗HCVIgM检测均为阴性，HCV rNA3次阳性(1995年3月、1996年1、6月)。6例感染HCV的血液透析患者抗HCVIgG的表现类型分为持续阴性及持续阳性两种；抗HCVIgM有四种表现，分别为：一过性阳性、间隙性阳性、持续阴性及持续阳性；HCV rNA检测多为间断阳性。
二、血液透析患者HCV E2/NS1区序列变异
扩增的PCR产物经双向引物直接进行序列测定得到长度为388bp的一段序列(HCV e2/NS1区序列，核苷酸位置1110-1497，氨基酸位置371-499)，发现6例患者感染的HCV株E2/NS1序列间存在差异(序列未列出)，核苷酸同源性范围为82.7％～96.1％，氨基酸同源性范围为79.8%～92.2%；此外，在1年半的追踪观察中发现同一患者感染的HCV株在不同时期的序列间存在差别，如表1。
讨论
目前临床应用抗HCVIgG检测主要用于筛选献血员及对HCV感染患者进行初筛，由于其在血清中出现的时间较晚，不能确定HCV的早期感染，因而有一定的局限性，而且，本研究病例1的检测结果证实：抗HCVIgG阴性并不排除病毒血症的存在，故而目前单靠抗HCVIgG筛选患者特别是确定健康献血员尚存在一定的不足之处。
表1 6例患者不同时期HCV E2/NS1区核苷酸与氨基酸变异
| 病例编号 | 比较日期 | 变异碱基位置 | 变异的碱基 | 变异氨基酸的位置 | 变异的氨基酸 |
| 1 | 1995年3月与1996年1月 | 1317 | C-T | 439 | - |
| 1337 | A-G | 446 | K-R | ||
| 1390 | G-A | 464 | E-K | ||
| 1411 | T-C | 471 | S-P | ||
| 1423 | A-G | 474 | T-A | ||
| 1996年1月与1996年6月 | 1284 | C-T | 428 | - | |
| 1357 | C-T | 453 | P-S | ||
| 2 | 1995年3月与1995年9月 | 1188 | T-G | 396* | I-M |
| 1195 | C-T | 399* | L-F | ||
| 1198 | A-G | 400* | T-V | ||
| 1199 | C-T | 400 | T-V | ||
| 1396 | C-T | 465 | T-M | ||
| 1995年9月与1995年10月 |
未发生变化 |
||||
| 3 | 1995年3月与1996年1月 | 1211 | C-A | 404* | T-N |
| 1334 | G-A | 445 | R-H | ||
| 1996年1月与1996年4月 | 1230 | A-T | 410* | K-N | |
| 4 | 1995年3月与1996年1月 |
未发生变化 |
|||
| 1996年1月与1996年6月 | 1151 | G-A | 384* | R-N | |
| 1190 | C-T | 397* | S-F | ||
| 1195 | A-T | 399* | I-F | ||
| 1345 | C-T | 449 | P-S | ||
| 5 | 1995年3月与1996年1月 | 1172 | T-C | 391* | V-A |
| 1336 | G-A | 446 | R-K | ||
| 1996年1月与1996年6月 | 1333 | A-C | 445 | N-T | |
| 1336 | A-G | 446 | K-R | ||
| 6 | 1995年3月与1996年1月 |
未发生变化 |
|||
| 1996年1月与1996年6月 | 1150 | A-G | 384* | S-G | |
| 1181 | A-G | 394* | H-R | ||
| 1183 | A-G | 395* | T-A | ||
| 1195 | C-T | 399* | L-F | ||
| 1230 | A-T | 410* | R-S |
注：*代表高变区1部位的氨基酸
同时本研究中抗HCVIgG检出阳性与HCV RNA的检出符合率很高，达61.5%(16/26)，表明抗HCVIgG阳性结果与HCV rNA的存在有一定的关联，对反映病毒血症的存在有重要的意义，也是反映疾病趋于慢性化的重要指标。此外，6例患者抗HCVIgG的两种截然不同的表现还可能反映了宿主不同的免疫状态，对研究不同HCV株感染对机体产生抗体的影响也有重要的作用。
一般认为，根据机体免疫应答抗体出现的规律，IgM型抗体先于IgG型抗体出现，因而血清抗HCVIgG检测对于感染早期诊断、区别急慢性感染有重要意义。本研究发现6例研究对象抗HCVIgM的表现类型不一(病例1、2、6抗HCVIgM持续阴性，病例3抗HCVIgM一过性阳性，病例5间隙性阳性，病例4在长达1年半的时间其抗HCVIgG持续阳性)，因此，对抗HCVIgM确切临床意义的探讨还必须综合考虑宿主免疫机能状态、感染的病毒株以及具体抗HCVIgM选择等多方面因素，尽管如此，我们仍然注意到抗HCVIgM与HCV rNA的存在呈很好的正相关，IgM阳性的同时HCV RNA的检出率高达78%(7/9)，因此，抗HCVIgM检测对说明病毒血症的存在具有重要的临床意义。
抗体检测方法操作简单、无需特殊的仪器设备，但是，正如前面我们所讨论的：单靠抗体检测还存在一定的局限性，还可能出现漏诊，因此，RT-PCR法检测HCV rNA尽管对设备、环境、人员要求很高，但却仍然必要。HCV RNA的存在是HCV在体内活动最直接的证据，有利于HCV感染的早期诊断，对于评价抗病毒疗效及估计疾病预后均有重要的意义［3］。此外，我们建议对HCV rNA检测阳性后转阴的病例不可忽视，应定期复查，并应高度重视RNA检测反复阳性的病例。
HCV E2/NS1区序列是HCV基因组中最易变异的区域，其中的高变区1(Hypervariable region 1 HVR1, 氨基酸位384410)基因在不同病毒分离株间存在很大的差别［4］，在疾病进行期该区基因变异更是频繁，HVR1基因变异被认为是宿主免疫选择作用的结果，是导致干扰素治疗效果不明显，疾病慢性化的重要原因。6例HCV感染者HCV e2/NS1区基因监测结果表明，HCV E2/NS1区序列在患者体内变异频繁，不同患者感染的HCV rNA在体内变异的部位、时间及变异率表现不一。通过与HCV RNA检测结果比较发现：HCV rNA检测结果阳转阴后经过所谓的静止期，再次检出HCV RNA时，其序列多已发生变化，提示此时病毒变异株逃避宿主的免疫清除而被选择出来成为新的优势株［5,6］，而病程则可能向慢性化方向发展。研究抗HCV抗体因素在病毒变异中的作用时，我们发现：在有无抗体生成的宿主体内均可有E2/NS1区基因的变异，但是，本研究对象病例1(抗HCVIgG、IgM始终为阴性)感染的HCV rNA在不同病程中的基因变异均发生在HVR1区以外，而其它有抗体生成病例感染的HCV rNA变异均可发生在HVR1区，提示体液免疫因素在选择高变区1变异中有重要的作用，但是它怎样发挥作用，抗HCV其它区域抗体是否也有类似的作用，对这些问题的讨论仍有待于进一步的研究。
作者单位：200438 上海，第二军医大学附属东方肝胆外科医院实验诊断科(方芳)；第二军医大学基础部微生物教研室(潘卫、戚中田、崔晓红、宋艳斌)
参考文献
1 Zonaro A, Puoti M, Friordalish G, et al. Detection of serum hepatitis C virus RNA in acute non-A, non-B hepatitis. J Infect Dis, 1991,163:923-924.
2 毕胜利，白宪鹤，丛勉尔，等.中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异.病毒学报，1993，9：114-126.
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4 方芳，潘卫，戚中田，等.我国丙型肝炎病毒囊膜蛋白E2高变区1的序列特征.中国病毒学，1998，13:34-39.
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6 Doorn LJ, Capreles I, Maertens G, et al. Sequence evolution of the hypervariable region in the putative envelope region E2/NS1 of hepatitis C virus is correlated with specific humoral immune response. J Virol, 1995,69:773-778.