幽门螺杆菌CagA蛋白的纯化与鉴定

【 摘要 】　目的　纯化幽门螺杆菌（Hp）相对分子质量（M_r）为130×10³(CagA)蛋白，为单抗及疫苗的研制打下一定基础。方法　 用盐酸胍粗提、分子筛层析及凝胶洗脱法纯化Hp97002株M_r为130×10³（CagA）蛋白并鉴定。用Western blot方法分析68例患者血清中M_r为130×10³（CagA）蛋白的阳性率。结果　纯化蛋白M_r为130×10³，电泳纯，并保持良好的抗原性。有43例患者血清能与纯化的M_r为130×10³（CagA）蛋白反应，其阳性率随着浅表性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌的排列次序呈逐渐增高趋势。结论　M_r为130×10³（CagA）蛋白与胃部疾病的严重性相关。

Purification and identification of CagA protein of Helicobacter pylori

YE Shaojing, FANG Pingchu, LI Chao

　　(long. College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310031, P.R.China)

　　【 Abstract 】　Objective　To purify and identify the CagA (cytotoxin-associated gene A) protein of clinical isolate Hp97002 and to investigate the relationships between the purified CagA (molecular weight of 130000) protein and gastric diseases.Methods　Using 6M guanidine extract, size exclusion chromatography and elusion from gel was the purified protein (CagA). Sera of 68 patients with gastric diseases (44 with chronic gastritis, 15 with atrophic gastritis, 7 with peptic ulcer disease, 2 with gastric cancer) were obtained, and the serological response to CagA was studied by Western blot using the purified protein.Results　The purified protein was molecular weight of 130000 with good antigenicity and revealed basic isoelectric point about 8.1. Among 68 sera, 43 sera could recognize the purified proteins from the patients of chronic gastritis 47.7% (21/44), atrophic gastritis 86.7% (13/15), peptic ulcer disease 100% (7/7), gastric cancer 100% (2/2), the difference was significant (χ²=13.327, P=0.004).Conclusion　CagA (molecular weight of 130000) protein was associated with severe gastric diseases.

　　【 Subject words 】　Helicobacter pylori; CagA; Elution from gel; Western blot

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染已被公认为人类慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的重要病因，并且与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关。全球范围内大约有50%～80%的成人有Hp感染^〔1〕。但Hp感染人群大多无症状，只有少数感染者可出现胃溃疡、十二指肠溃疡，极少数感染者最终发展为胃癌。出现上述不同感染结果的主要原因是Hp菌株的多样性^〔2，3〕。国外目前的研究表明，Hp菌株cagA (cytotoxin-associated gene A)及其表达产物CagA蛋白与胃部疾病的严重性相关^〔4-6〕，但CagA蛋白的功能迄今尚不清楚。本实验采用膜蛋白的分离纯化原理和技术，对Hp临床分离株Hp 97002的相对分子质量(M_r)为130×10³（CagA）蛋白进行分离纯化，并对其与胃部疾病的关系作初步探讨，为进一步研究CagA在胃部疾病发生发展过程中的作用打下基础。

　　材料与方法

　　菌株和生长条件：Hp97001、Hp97002、Hp97003、Hp97004和Hp97005菌株，从临床胃粘膜活检标本分离，并经系统鉴定。NCTC11637为CagA阳性Hp国际标准株。上述Hp菌株分别接种于ECY固体培养基^〔7〕，微需氧（5% O₂，10% CO₂，85% N₂）37℃培养48 h，用PBS洗下菌苔，5 000r/min，20 min离心洗涤2次，存放于-20℃备用。

　　血清：Hp阳性人血清为5份Hp培养阳性的胃溃疡患者的混合血清。Hp阴性人血清为经血清学、组织学、Hp培养、¹⁴C呼气试验证实无Hp感染的1份健康人血清。兔抗Hp血清来自NCTC11637免疫家兔获得的血清。

　　胍提取抗原的制备：将冻存的Hp用PBS稀释至适当浓度，经6mol/L盐酸胍处理，其上清即为胍提取抗原。

　　SDS-PAGE：参照Leammli^〔8〕不连续电泳方法。

　　Western blot：样品经SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜(10V，20 h)。滤膜封闭后与一抗作用2 h，洗膜后移入二抗溶液(HRP-SPA)中孵育2 h；再洗膜4次后用二氨基联苯胺(DAB)显色。

　　分子筛层析：选用Sephadex G-200(粒度40～120μm，Pharmacia公司)，柱型为1.6×100cm，在层析成套设备（LKB公司）中进行。

　　凝胶洗脱法：参照Bernabeu^〔9〕方法。

　　凝胶等电聚焦电泳：采用2% Ampholine（pH 3～10），阴极电极液为0.02 mol/L NaOH，阳极电极液为0.01 mol/L H₃PO₄，恒压180V，电泳聚焦6 h。

　　纯化蛋白与胃部疾病的关系：68例因胃部疾患就诊于浙医一院的门诊患者。以内窥镜检查，于胃窦和胃体部取活检标本各一块。活检组织进行Hp培养和组织学检查，并作快速尿素酶试验和直接涂片镜检Hp。每人同时采血2ml，分离血清。经组织学证实浅表性胃炎44例，萎缩性胃炎15例，消化性溃疡7例，胃癌2例。采用Western blot方法分析纯化的M_r 为130×10³ (CagA)蛋白与胃部疾病的关系，结果采用SPSS 8.0 for Windows 98统计软件包，进行Chi-square(χ²)和Spearman′s相关分析。

　　结果

　　1．Hp97002 M_r为130×10³（CagA）蛋白的纯化：Hp97002盐酸胍粗提上清液，经Sephadex-G200分子筛层析，共出现A、B、C和D 4个相互分离的280nm吸收峰（图1），获得相应的4个组分。SDS-PAGE结果显示，M_r为（128～140）×10³的蛋白质在A组分内。

　　图1　Hp97002胍提取蛋白分子筛层析洗脱曲线

　　Fig 1．Isolation of H.Pylori 97002 guanidine extract with Sephadex G-200 chromatography

　　2．纯化蛋白的鉴定：纯化蛋白经SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色，为单一条带，M_r为130×10³（见图2）。Western blot结果显示，CagA阳性国际标准株NCTC11637兔免疫血清能识别纯化蛋白，仅出现一条反应带。而胍提取液则存在多条印迹条带，在M_r为（128～140）×10³区域内则只有一条印迹带，其相对分子质量与纯化的蛋白一致，提示两者为同一蛋白。凝胶等电聚焦电泳结果显示，该M_r为130×10³纯化蛋白的等电点（pI）为8.1。

　　图2　纯化蛋白SDS-PAGE分析

　　Fig 2．SDS-PAGE analysis of purified H. pylori protein

　　The separating gel contained 10% acrylamide

　　Lane 1: guanidine extract, lane 2: fraction A of gel filtration chromatography, lane 3: purified H.pylori protein, lane 4: M_r marker

　　3．纯化M_r为130×10³(CagA)蛋白与胃部疾病的关系：68例患者中Hp阳性51例，其中浅表性胃炎Hp阳性率为72.1 %(31/43)，萎缩性胃炎为86.7%(13/15)，消化性溃疡为85.7%(6/7)，胃癌为50%(1/2)。经精确计算的Chi-square检验(χ²=2.407, P=0.475),差异无统计学意义（见表1），表明Hp阳性率与上述4种胃部疾病无明显的相关性。68例患者血清中43例能与纯化的M_r为130×10³(CagA)蛋白反应(图3)，其阳性率分别为：浅表性胃炎47.7%(21/44)，萎缩性胃炎86.7%(13/15)，消化性溃疡100%(7/7)，胃癌100%(2/2)。经精确计算的Chi-square和Spearman′s相关分析，上述胃部疾病的CagA阳性率差异有显著性(χ²=13.327, P=0.004)，并随着浅表性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌的排列次序呈逐渐增高的趋势，两者有明显的相关性（r_s=0.442, P=0.001），见表1。

　　讨论

　　目前有关CagA抗原提取方法的报道较少，国外主要从含血清的布氏培养上清中粗提Hp CagA蛋白，经50%硫酸铵盐析，疏水交互层析，分子筛层析和离子交换层析纯化CagA蛋白^〔10〕。由于从培养上清中提取CagA蛋白需特殊的微需氧悬浮振荡培养装置，并且混杂血清蛋白成分，本实验尝试用ECY无血固体培养基培养Hp，菌体经6mol/L盐酸胍抽提，Sephadex-G200分子筛层析和凝胶洗脱法纯化CagA蛋白获得成功。本实验方法简便易行，无需特殊仪器设备，获得的CagA蛋白纯度高，抗原性良好，为CagA蛋白的深入研究奠定了基础。

表1　四种胃部疾病的Hp、CagA阳性率

　　Table 1． The links among prevalence of CagA, H.pylori and four gastric diseases

	Chronic 　　gastritis 　　(n=44)	Atrophic 　　gastritis 　　(n=15)	Peptic ulcer 　　disease 　　(n=7)	Gastric 　　cancer 　　(n=2)
CagA*+	47.7%(21)	86.7%(13)	100%(7)	100%(2)
Hp#　+	72.1%(31)	86.7%(13)	85.7%(6)	50.0%(1)

　　*χ²=13.327, P=0.004; Spearman′s r_s=0.442, P=0.001

　　#χ²=2.407, P=0.475

　　图3　胃部疾病患者血清与纯化M_r为130×10³(CagA)蛋白Western blot图谱

　　Fig 3．Western blot of sera from patients with gastric disease against the purified M_r＝130×10³(CagA) protein

　　Lane a: mixed serum of five H.pylori-infected patients with gastric ulcer, lane b: serum from a rabbit immunized with NCTC11637 strain, lane c: serum obtained from a H.pylori-uninfected person, lane d-g: sera of patients with gastric diseases

　　CagA蛋白的鉴定，尚无直接简便的方法。Covacci^〔11〕等克隆的CagA基因开放阅读框编码1 147氨基酸残基，计算相应CagA蛋白M_r为128 012.73，等电点为9.72；而Tummuru^〔12〕等克隆的基因推算其相应CagA蛋白M_r为131 517，等电点为8.89。本实验获得的纯化蛋白，M_r为130×10³，免疫显性，亲水性强，等电点为8.1（与推算的CagA蛋白的等电点相近，均为碱性蛋白），且与萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌相关，均与文献报道的CagA蛋白特性的结果一致^{〔11，12〕}，因此推测该M_r为130×10³蛋白即为CagA蛋白。

　　临床资料显示，CagA阳性亚型感染增加发生消化性溃疡、萎缩性胃炎和胃癌的危险性^〔4,6,13〕。本实验用Western blot 法对M_r为130×10³ (CagA)蛋白与胃部疾病的关系作了分析。发现68例患者血清中，有43例能与纯化M_r为130×10³（CagA）蛋白反应，其阳性率随着浅表性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌的排列次序呈逐渐增高趋势，表明CagA蛋白与胃部疾病的严重性相关，而Hp阳性率与上述4种胃部疾病无明显的相关性。

　　对Hp CagA蛋白的深入研究，不仅有助于揭示Hp的致病机理，而且对指导Hp感染的诊断、治疗及免疫预防等方面均具有十分重要的意义。

　　基金项目：浙江省自然科学基金资助项目(397034)；CMB资助项目(96-628)

　　参考文献

　　1，张红杰．具有CagA、VacA基因的幽门螺杆菌与胃肠疾病．国外医学内科学分册, 1998, 25(3)：99-101．

　　2，Blaser MJ. Heterogeneity of Helicobacter pylori. Eur J Gastroenterol Hepatol, 1997，9 (Suppl 1): S3-6.

　　3，Megraud F. Pathogenic diversity of Helicobacter pylori. J Gastroenterol, 1997, 32(2): 278-281.

　　4，Blaser MJ, Guillermo1 Perez-perez, Harry Kleanth-ous, et al. Infection with Helicobacter pylori strains possessing CagA is associated with an increased risk of developing adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res, 1995, 55(10): 2111-2115.

　　5，Lee A. The nature of Helicobacter pylori. Scand J Gastroenterol ,1996, 31 (Suppl 214):5-8.

　　6，Peek RM Jr, Moss SF, Tham KT, et al. Helicobacter pylori CagA⁺ strains and dissociation of gastric epithelial cell proliferation from apoptosis. J Natl Cancer Inst, 1997, 89(12): 863-868.

　　7，方平楚. 幽门螺杆菌ECY无血清培养基的研究. 中华医学检验杂志, 1993, 16(3):131-133.

　　8，Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature(London), 1970, 227:680-685.

　　9，Bernabeu C, Conde FP, Vazquez D. Extraction of pure ribosomal protein and removal of coomassie blue from acrylamide gels. Analytical Biochemistry, 1978, 84: 92-102.

　　10，Van der Ende A, Rauws EA, Feller M, et al. Heterogeneous Helicobacter pylori isolates from members of a family with a history of peptic ulcer disease. Gastroenterology ,1996, 111(3): 638-647.

　　11，Covacci A, Censini S, Bugnoli M, et al. Molecular characterization of the 128kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associaed with cytotoxicity and duodenal ulcer. Pro Natl Acad Sci USA, 1993, 90(6):5791-5795.

　　12，Tummuru MK, Cover TL, Blaser MJ. Cloning and expression of a high-molecular-mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immun, 1993, 61(5):1799-1809.

　　13，Sozzi M, Valentini M, Figura N, et al. Atrophic gastritis and intestinal metaplasia in Helicobacter pylori infection: the role of CagA status. Am J Gastroenterol, 1998, 93(3): 375-379.