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免疫新分子的发现及其研究进展
中国免疫学杂志 1999年第6期第15卷 述评
作者：曹雪涛
单位：第二军医大学免疫学教研室，上海200433
机体免疫应答的实质是免疫分子的相互识别和相互作用。免疫分子参与包括免疫细胞等在内的多种细胞的增殖分化及功能调节。一种重要免疫新分子的发现，往往会开辟一个新的研究领域，带动诸多相关学科的发展，对揭示免疫应答、炎症和造血细胞的分化发育等重大生命过程的本质及其调节规律产生深远影响；此外，一个重要的免疫分子本身就可作为一种蛋白质药物或作为药物设计的靶点，在抗肿瘤、抗感染、抗移植排斥、促进造血恢复和治疗自身免疫性疾病等方面具有潜在的临床应用前景。因此，免疫新分子的发现和研究具有重要的理论探索意义和实际应用价值，已成为当今免疫学乃至整个生物医学领域的热点，进展很快。本文着重就发现和克隆免疫新分子的策略以及该领域的研究热点作一述评，并简要介绍本室最近开展的相关工作。
1 寻找和克隆免疫新分子的策略
克隆未知免疫分子的经典策略是在已知其生物学活性或具备其相应的抗体或配体的情况下，通过筛选基因文库获得未知分子的全长cDNA；利用免疫沉淀技术能发现功能相关的未知蛋白，如通过抗CD3抗体免疫沉淀分离到了TCR的不同亚基，以及通过抗IL-6R α链抗体免疫沉淀发现了gp130信号传导链等［1］；通过差异显示或差减杂交寻找组织特异表达基因、利用PCR技术克隆同一家族的同源基因或利用酵母体系克隆新基因也是有效的途径；近年来，真核表达克隆(Expression cloning)的应用范围已被大大拓展，通过基因文库的随机大规模测序和EST的同源比较寻找和克隆免疫新分子更是大显身手，卓有成效。
1.1 核酸分子杂交筛选基因文库 已知部分核苷酸信息时，核酸分子杂交筛选基因文库是克隆新分子的基本策略。依据不同的情形，可利用不同的核酸分子作为文库筛选的基因探针。
1.1.1 寡核苷酸探针筛选 先通过蛋白纯化和氨基酸测序获得其少数氨基酸序列，从中推导出可能的核酸序列，根据遗传密码的简并性(Degeneracy)，合成一组寡核苷酸探针进行基因文库的筛选。这在新分子克隆的早期应用较多，许多细胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IFN-α、IFN-β和IFN-γ以及细胞因子受体CD25等［2］，就是先纯化到该蛋白，然后通过寡核苷酸探针筛选cDNA文库克隆到全长基因。目前该策略已基本被文库的表达筛选所取代。
1.1.2 核酸探针筛选 当对所需筛选的目的基因序列有所了解(如同源序列或基因家庭的保守序列等)或已获得部分基因片段(如来源于差异显示)时，通过制备核酸探针，采用经典菌落或噬菌斑印迹原位杂交方法克隆全长cNDA。利用大肠杆菌中参与DNA修复的RecA蛋白介导标记的单链DNA 探针与同源的双链DNA形成三链复合体的原理，通过生物素-亲和素磁珠标记系统可有效富集阳性克隆从而可快速筛选基因文库［3］。
1.2 抗体筛选原核表达文库 当具备未知免疫分子的抗体时，可用其筛选可能含有靶基因的原核表达文库。原核表达文库一般采用一套含有三种不同读框的系列载体(如Biolabs的pET系列)、以融合蛋白的形式表达目的基因，可通过定向克隆将cDNA片段插入载体，使任一具有读框的cNDA片段均可能产生正确的表达产物。利用该策略，曾成功克隆到包括肿瘤抗原在内的免疫分子。
1.3 真核表达文库的功能筛选 真核表达文库的功能筛选或称表达筛选(Expression cloning)是克隆未知免疫分子的有效途径。哺乳细胞作为基因文库筛选的宿主细胞，其最大优势在于能对蛋白产物进行正确的加工处理，使其以天然构象得到表达，可通过功能学及免疫学检测等方法进行筛选。真核细胞表达有稳定表达和短暂表达两种不同的策略。稳定表达筛选的局限在于获得稳定表达的转染细胞株比较费时，从宿主染色体DNA中分离转染的DNA比较困难。最初是将人肿瘤细胞中编码癌基因的基因组片段导入哺乳细胞进行稳定表达，用于筛选癌基因的基因组DNA。后来，稳定表达与免疫筛选相结合，成功分离了编码人HLA和β2微球蛋白基因组DNA，以及CD4、CD8的cDNA。短暂表达的优势在于能快速制备及筛选转染克隆株进行靶蛋白的检测，以及能从克隆细胞中有效回收编码cDNA。在具备快速而敏感的生物学检测方法时，直接通过检测短暂表达产物的特定生物学活性筛选表达文库分离细胞因子cDNA，无需先进行靶蛋白的纯化，这方法首先用于克隆GM-CSF cDNA［4］，后来还成功克隆了IL-4和IL-5的cDNA；此外，运用反应性T细胞还可进行肿瘤抗原的表达筛选。在具备抗体的条件下，将短暂表达与免疫淘选(panning)技术相结合能有效分离膜表面分子，如曾成功地筛选了T细胞的膜分子CD2和CD28［5］，以及胞内的溶酶体膜蛋白CD63等免疫分子［6］。当没有膜表面受体分子的相应抗体时，可用其相应配体进行表达文库的功能筛选，分离细胞因子受体(如IL-1R等)［7］。总之，表达筛选的应用范围已被大大拓展，甚至在克隆细胞内信号传导相关蛋白中也得到成功的应用［8］。
1.4 利用差减杂交和差异显示筛选差异表达新基因 差减杂交(Differential hybridization)和差异显示(Differential display, DD)技术是筛选组织特异表达或特定功能状态下特异表达基因的有效策略。差减杂交技术能有效鉴定细胞中高表达的基因，但难以显示那些低丰度基因；采用经吸附的探针和差减文库有助于分离低丰度基因。通过差减杂交和构建差减文库，克隆不同免疫细胞间或不同免疫状态下差异表达基因有不少成功的报道。
mRNA差异显示技术作为筛选差异表达基因的有效手段［9］，与差减技术相比，其主要优点是：①仅需要少量的细胞总RNA，这在细胞来源困难时显得更为突出；②通用性好，适用范围广，可同时进行批量样本的检测，能同时检测基因表达的上调和下调，而差减技术仅能单向地检测基因表达的调节，即仅能检测上调或下调的基因。DD技术也存在两个明显的缺点：①产生的大量差异片段假阳性率高(50%～75%)，其主要原因是在特定电泳条带中含多种DNA片段以及不同丰度RNA竞争PCR引物；②能分离出来的差片段很短(110～450 bp)，且大多数来源于3′非编码区(UTR)，需通过文库筛选等方法获得更长片段或全长基因。目前，利用该策略克隆免疫分子的成功报道不多，也尚未见利用DD技术克隆大量真正差异显示基因的报道。
1.5 基因文库的大规模测序和EST同源比较 在计算机技术和生物信息学(Bioinformatics)高度发达的今天，通过基因文库的随机测序可产生大量的EST(Expressed sequence tag)， 通过与已有数据库的搜索比较发现新基因，根据同源比较和结构分析预测新分子可能的生物学功能，这在寻找和克隆免疫新分子中大显身手，独领风骚。近来，通过该策略相继克隆到了TNF及其受体超家族的多个新成员(如TRAIL及其受体)，发现了许多新的趋化因子和一些其它重要的免疫相关分子。法国Lebecque实验室从人树突状细胞的cDNA文库中寻找到了serpin家族新成员decysin、活化后负调节分子DORA(Down-regulated by activation)、Ig样的跨膜蛋白FDF03和DC的溶酶体相关膜蛋白(DC-LAMP)等免疫新分子［10］。本室通过人树突状细胞cDNA基因文库的大规模测序也成功分离到一些免疫新分子［11］。
1.6 cDNA末端快速扩增(RACE)技术 在寻找和分离新基因的过程中，所得到的基因克隆常常是mRNA完整序列的一部分，传统的方法是通过筛选文库克隆其全长基因，新近建立的PCR扩增方法可快速克隆相关片段的未知序列，已成为克隆全长基因的常规方法。和文库筛选相比，RACE克隆全长基因具有以下优点：①文库筛选通常历时数周，PCR可在几天内得到所需信息；②文库筛选通常得到一个或几个cDNA克隆，RACE可产生无数独立的克隆，大量克隆的获取可以进一步确认核苷酸序列，分离由于不同剪接方式或由不常有的启动子指导合成的稀有转录产物。
1.7 利用简并引物的PCR扩增 根据家族中同源基因的保守氨基酸序列设计简并引物，例如根据已知的趋化因子受体第2个胞内loop和第7个跨膜区保守序列设计的简并引物，成功地从人肺组织来源的DC中克隆到MIP-3α的受体DCCR2，经确认与CCR7一致。
1.8 酵母体系 酵母是一种单细胞真核生物，它不仅具有原核生物生长快、易于培养和遗传操作等优点，而且还具有典型的真核生物的特性，是研究真核蛋白的理想宿主。酵母双杂交系统在寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白时是一有效途径，以研究胞内蛋白相互作用见长。近年来建立的酵母信号肽捕获系统在选择性克隆含信号肽序列的新分子中具有潜在的优势。有人首先提出利用信号肽捕获克隆分泌蛋白和膜分子的概念［12］。酵母信号肽捕获系统适合于进行大规模筛选克隆，其原理是，酵母细胞在蔗糖或棉子糖为唯一碳源的条件培养基中生长时，需分泌一种转化酶；将外源cDNA插入本身信号肽序列缺失的转化酶基因上游，当含信号肽序 外源基因以正确的读框与转化酶基因融合时，就能产生并分泌转化酶，从而使酵母能在含蔗糖或木棉子糖的培养基中生长，达到选择性克隆含信号肽的分泌性蛋白或膜蛋白的目的。由于大部分免疫子都是分泌蛋白，因此该系统在克隆免疫新分子中具有应用价值。
通过与酵母的信号传导通路偶联可能为克隆孤儿受体的配体提供新的技术手段，最近在克隆未知功能的G蛋白偶联受体激动剂中得到了成功应用［13］。酵母的G蛋白βγ亚单位是酵母信息素效应的起始途径，受刺激激活后能在无组氨酸的条件培养基中生长；通过建立含有哺乳细胞和酵母细胞杂合Gα亚单位的基因工程酵母细胞株，使哺乳细胞G蛋白受体与酵母的信息素效应的信号传导通路进行成功的偶联。将待克隆配体的G蛋白受体导入该基因工程酵母细胞株，通过内源性共表达或给予外源蛋白刺激，寻找其配体。
2 免疫新分子研究领域的几个热点
免疫新分子的研究日新月异，几乎不同免疫分子家族都陆续有新成员的发现，如TNF家族、TGF家族，干扰素家族和白细胞介素家族新成员以及新的造血生长因子与细胞因子或细胞因子受体作用相关的新分子等，有的还有待于进一步得到公认和正式命名［13-17］；此外，还可能发现免疫分子的新家族。目前，发现免疫新分子的主要策略是表达克隆和计算机搜索分析。
2.1 TNF及其受体超家族 TNF受体超家族是细胞因子受体中的一个大家族，包括Ⅰ型和Ⅱ型TNFR、NGFR、CD27、CD30、OX40(CD134)、4-1BB、CD40和Fas以及新近发现的新成员，其结构特征是胞外区段有160个氨基酸的同源区，由富含Cys的四个结构类似的区域重复组成(每个区域通常含有4～6个Cys)，活化后可传导细胞凋亡信号，是近年来免疫分子中的一大研究热点。
2.1.1 Fas/FasL及其相关分子 Fas广泛表达于机体的组织细胞，受激活后导致细胞内半胱氨酸蛋白酶caspase8活化，启动细胞凋亡通路，是免疫杀伤细胞的效应机理之一，与肿瘤的免疫耐受、免疫系统的阴性选择等生命过程有关［18］。最近的研究表明，Fas/FasL的凋亡作用是一受到精细调节的过程，从活化的T细胞中克隆的Toso就是一造血细胞中特异的凋亡信号负调节因子，为免疫球蛋白超家族成员，能通过阻断caspase8阻断Fas、FNFR1和FADD介导的细胞凋亡［19］。
2.1.2 TRAIL及其受体：TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是近年来搜索EST是发现的、与TNF和Fas同源的TNF家族新成员，能诱导转化细胞和肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无细胞毒作用，因此具有重要的免疫监督功能［20］。目前通过EST的同源比较至少发现了四种TRAIL的受体，即DR4、DR5以及无胞内信号传导区的诱导受体DcR1和DcR2，揭示了机体受体调节的新机制。
2.1.3 RANK和RANKL(TRANCE) RANK(Receptor activator of NF-κB)为与CD40同源的Ⅰ型跨膜蛋白，通过DC基因文库的随机测序发现的；RANKL为Ⅱ型跨膜蛋白，是在发现RANK的基础上，通过表达筛选从T细胞中克隆的，与CD40L同源，能增强DC的活力［21］。
2.1.4 TNF及其受体超家族的其它新成员 LIGHT来源于活化的T细胞，与TNF-β同源，是LTβ受体和TR2(HVEM)的配体，对肿瘤细胞的生长具有抑制作用［22］。TL1(VEGI)从脐静脉内皮细胞文库中发现的TNF家族新成员，对内皮细胞的生长具有抑制作用。此外，新近发现的TNF受体超家族新成员还包括具有促进骨形成作用的TR1(OPG)和具有T细胞刺激活性的TR2(HVEG)［23］。
2.2 趋化因子及其受体超家族 趋化因子在白细胞的体内游走、迁移和分布中发挥重要作用，参与机体免疫应答的调节，与感染(如HIV)、肿瘤等密切相关［24］。目前发现的趋化因子至少有50种，成熟分子的大小为68～120AA，含有保守的Cys结构，根据其Cys结构域特点，至少可分为四个亚家族，不同亚家族的趋化因子具有不同的功能特点。C-X-C亚家族，其结构特点是氨基端的两个Cys中间隔一个非保守氨基酸，包括IL-8等，能趋化中性粒细胞，对单核细胞无趋化活性；C-C家族，是趋化因子中的最大家族，在人包括20多个成员，其结构特点是氨基端的两个Cys连续排列，主要趋化单核细胞和淋巴细胞，对中性粒细胞无趋化作用；C亚家族，目前仅有淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)一个成员，氨基端仅含有1个Cys，能特异性趋化T淋巴细胞和NK细胞；CX3C家族，其结构特点是氨基端两个Cys中间隔三个非保守氨基酸，对T细胞具有趋化活性。趋化因子受体属于G蛋白偶联受体超家族，是一含有7个疏水性穿膜区段的单链受体，对pertussis毒素敏感，具有保守的氨基酸结构(如胞内第二个环状结构区有一DRYLAIV结构域)，胞内区与G蛋白偶联，C末端含丝氨酸/苏氨酸，可产生磷酸化，参与信号传导，见表1。
表1 趋化因子受体及其配体
| 趋化因子受体 | 相应配体 | 受体表达的细胞 |
| CCR1 | MIP-1α，RANTES，MCP-3 | 单核细胞，T细胞 |
| CCR2 | MCP-1，MCP-3，MCP-4， | 单核，嗜碱，T细胞 |
| CCR3 | eotaxin,RANTES,MCP-2,3,4 | 嗜酸，嗜碱 |
| CCR4 | RANTES，MIP-1α，MCP-1 | 嗜碱，T细胞 |
| CCR5 | RANTES，MIC-1α，MIP-1β | 单核，T细胞 |
| CCR6 | MIP-3α | DC |
| CCR7 | MIP-3α | DC |
| CCR8 | MIP-Iβ，TARC，I309 | T细胞 |
| CXCR1 | IL-8 | 中性粒，NK |
| CXCR2 | IL-8，GROα，NAP-2，ENA-78 | 中性粒NK |
| CXCR3 | IP-10，Mig | 活化T细胞 |
| DXCR4 | SDF-1 | 广泛表达 |
| SXR1 | lymphoactin | T细胞，NK细胞 |
2.3 免疫抑制性受体 免疫抑制性受体是近年来发现的免疫分子新家族［25］。BCR、TCR和一些Fc受体复合物与天然配体结合后通常引起受体胞浆内免疫受体酪氨酸相关的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM)的酪氨酸磷酸化，继而激活蛋白酪氨酸激酶，引发细胞内一系列连锁的蛋白磷酸化反应，导致细胞的活化。免疫细胞的激活受到不同层次的精细调节。在造血细胞中发现的免疫抑制性受体，能对细胞的活化发挥负调节作用，其结构特点是含有一个或多个免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM)，ITIM由6个氨基酸组成的保守序列(I/L/VXYXXL/V，X代表任一氨基酸)。当免疫抑制受体与刺激受体偶联时，ITIM发生酪氨酸磷酸化，然后与SHP1蛋白酪氨酸磷酸酶或/和SHIP肌醇磷酸酶的SH2结合，产生细胞活化的负调节效应。目前已知的免疫抑制性受体包括IgG低亲和力受体(FcγRIIB)、CD22、Ly-49、杀伤细胞抑制受体(KIRs)、NKG2A/CD94异源二聚体、肥大细胞49B1糖蛋白、Ig-SF、信号调节蛋白(SIPα)和Ig样转录产物(ITL-1，2，3)等，其编码基因多属于免疫球蛋白基因家族和C型凝集素家族。此外，在非造血组织也存在拮抗生长因子受体的抑制性受体，可能与肿瘤有关。
2.4 肿瘤抗原 肿瘤抗原的研究对阐明肿瘤的发生机理和肿瘤的诊治具有重要意义。因此，人们一直致力于寻找和克隆肿瘤抗原，早期主要用抗体去筛选肿瘤抗原，由于机体的T细胞免疫应答是抗肿瘤免疫的主要部分，而肿瘤抗原多以多肽的形式表达于肿瘤细胞的表面，现在多用肿瘤抗原相关的T细胞，如肿瘤浸润的T淋巴细胞(TIL)作为识别工具，通过筛选含肿瘤抗原的真核表达文库克隆肿瘤抗原。迄今为止，已克隆到多个黑色素瘤肿瘤抗原，包括酪氨酸酶、gp100、MART-1和TRP-1等，仍致力于寻找乳腺癌、肝癌、肾癌等恶性肿瘤的肿瘤抗原。目前发现的肿瘤抗原多为正常组织的分化抗原。通过定点突变技术可进一步明确T细胞识别的肿瘤抗原多肽基序。
3 本室在免疫新分子领域开展的工作
树突状细胞(Dendritic cells, DC)是体内重要的抗原提呈细胞，组织含量极微，由于细胞来源的困难，以往DC的研究很难深入开展。自从1992年Steinman实验室首先建立DC大量培养扩增方法，DC的研究进展很快，成为当前免疫学及其相关学科的一大热点，而从DC中寻找免疫新分子又是一个很活跃的课题，如特异趋化静息T细胞的趋化因子DC-CK1与DC分化发育相关的TNF受体超家族新成员RANK就是从DC基因文库中发现的［21］。本室在以研究DC分化发育和DC介导的肿瘤免疫治疗和基因治疗的基础上，通过cDNA的大规模随机测序和差减杂交两种不同策略开展了从人树突状细胞中克隆免疫新分子的研究。目前，已成功建立有关的技术体系，通过大规模随机测序已完成人树突状细胞cDNA文库的12000余条EST的测序工作，其中未知EST占16%左右，具有比较明确生物学功能的未知EST250余条，已克隆到全长新基因109条，其中生物学功能比较明确的全长新基因60余条，与免疫直接相关的全长新基因8条(包括新的细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子如cadherin)。通过建立基于长距离PCR技术的减法杂交，筛选抗原刺激前后树突状细胞差异表达基因，发现了几个功能比较明确的新基因，如与大鼠谷胱甘肽硫转移酶高度同源的基因、人M4基因缺失突变体与C. elegans染色体Ⅲ中一推导基因高度同源的基因以及含有myb结构域可能是转录调节因子的基因等。目前，正集中开展几个免疫新分子的功能研究。
作者简介：
| 曹雪涛，男，35岁，教授，博士生导师，第二军医大学免疫教研室主任，全军免疫与基因治疗重点实验室主任。《中国肿瘤生物治疗杂志》常务副主编、《国外医学免疫学分册》副主编、《中国免疫学杂志》编委、中国免疫学会基础免疫专业委员会副主任委员、中国免疫学会肿瘤免疫与生物治疗专业委员会副主任委员等。承担了多项国家、“863”重大项目、国家自然科学基金重点项目、军队九五攻关项目等。国家杰出青年科学基金获得者。以第一完成人获得军队科技进步一等奖1项、二等奖2项。以第一申请人申报国家发明专利9项。主要从事肿瘤免疫学和分子免疫学研究。 |
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〔收稿1999-04-09〕