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T细胞无能与凋亡关系初探
中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：范祖森② 马宝骊 王利 柏峻
单位：上海第二医科大学上海市免疫学研究所，上海200025
关键词：T细胞无能；凋亡；Fas mRNA
摘 要 目的：探讨无能T细胞与凋亡的关系。方法：利用B7-1单抗和环孢素A(CsA)联用处理APC即T细胞系统，在体外诱致抗原特异性T细胞无能，用PI染色法经FACS分析了无能T细胞的凋亡，用RT-PCR法检测了凋亡细胞Fas mRNA的表达水平。结果：无能T细胞在1、3、5、10 d细胞凋亡的百分率依次为2.16%、11.28%、19.27%、41.22%。当加入100 U/ml IL-2维持培养，无能T细胞未显示明显凋亡。无能T细胞活化后经PHA、PMA+A23187、CD3单抗再次诱导，24 h便发生明显凋亡，凋亡百分率分别为34.64%、21.27%、15.07%，活化后的T细胞及无能T细胞凋亡时Fas mRNA上调表达。结论：无能T细胞在体外是逐渐发生凋亡的，Fas/FasL参与细胞凋亡过程。
中国图书分类号 R392
Preliminary study on the correlation between T cell anergy and apoptosis
FAN Zu-Sen, MA Ba-Li，WANG Li et al. Shanghai Second Medical University，Shanghai Institute of Immunology，Shanghai 200025
Abstract Objective:Study the correlation between T cell anergy and apoptosis.Methods:Antigen-specific T cell anergy was induced by the combination B7-1mAb and cyclosporinA(CsA) in vitro.Anergic T cell apoptosis was analyzed by FACScan with PI-staining. Fas mRNA expression in apoptic cells was detected with RT-PCR.Results:Apoptic percentage of anergic T cells were 2.16%,11.28%,19.27%,41.22%during 1 d,3 d,5 d,10 d.Evident apoptosis was not observed in the anergic T cells cocultured with 100 U/ml IL-2. PHA-activated anergic T cells reactivated by PHA,PMA+A23187 and CD3mAb showed significant apoptosis at 24 h, their apoptic percentages were 34.64%,21.27%,15.07%,respectively.Fas mRNA dramatically up-regulated expression in T cells and anergic T cells activated with the above stimuli.Conclusion:Anergic T cell was gradually apoptic in vitro Fas/Fasl interaction participated in the apoptosis.
Key words T cell anergy Apoptosis Fas mRNA
自身反应性T细胞在胸腺内排除是不完全的，在成熟淋巴细胞中存在着自身反应性T细胞，机体仍处于免疫自稳状态，表明成熟T细胞是可以产生免疫耐受的。这些无能T细胞是一直存在，还是被排除，目前尚未见研究报道。Daniel等发现转染B7的肿瘤细胞可阻止CTL发生凋亡，推断缺乏共刺激信号，能够增强T细胞凋亡的敏感性［1］。研究报道，凋亡不仅局限于未成熟或转化的T细胞，在表达TCRαβ或γδ的成熟T细胞亦可发生凋亡［2，3］。又有报道淋巴细胞激活诱导后，除伴有细胞因子产生和增殖外，同时可发生激活诱导的细胞死亡(Activation-induced cell death，AICD)［4，5］。AICD可能是外周反应性T细胞被排除的机制，在免疫应答调节中具有重要作用。本文在体外诱导了无能T细胞模型，研究了无能T细胞与凋亡的关系，并对凋亡的机制进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 健康人外周血购自上海市血液中心; CTLL细胞株由本室保存。
1.1.2 主要试剂 淋巴细胞分层液:上海试剂二厂;TT:中科院上海细胞生物学研究所叶敏教授惠赠;抗B7-1单抗(BB1单抗)、抗CD3单抗(G19-4):由美国华盛顿大学E A Clark教授惠赠;CsA:瑞士Sandoz Pharmaceuticals公司产品;AET、丝裂霉素C(mito-C)、PHA-P、PMA、A23187:均为Sigma公司产品;IL-2:华新生物工程公司产品;细胞总RNA提取试剂盒Trizol、RT-PCR试剂盒购自Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 APC及T细胞的分离 采用AET法。
1.2.2 抗原特异性无能T细胞的诱导 APC经mito-C处理后，再与TT(10 μg/ml)或PPD(15 μg/ml)培养过夜，洗涤3次。将APC与T细胞以1∶3的比例混合，加入抗B7-1单抗(10 μg/ml)和CsA(500 ng/ml)，培养3 d，收集细胞，上淋巴细胞分层液，分离T细胞。
1.2.3 激活剂对无能T细胞的活化诱导 将无能T细胞及外周血T细胞加入96孔板(3×106/孔)，然后加入PHA(3 μg/ml)和IL-2(50 U/ml)，培养16 d，用淋巴细胞分层液除去死亡细胞。活细胞洗涤后，再分别加入PHA(10 μg/ml)、抗CD3单抗(10 μg/ml)、PMA+A23187(各10 ng/ml)培养24 h，收集细胞，FACS分析凋亡细胞。
1.2.4 凋亡细胞的检测 1×106 个细胞，加入1 ml PBS，慢慢滴加2 ml冰冻无水乙醇，混匀，固定细胞，4℃保存。 PI染色前，先用PBS洗涤，去除固定液，加入200 μl RNase A 37℃，水浴30 min，再加入800 μl PI染色液混匀，至4℃避光30 min，上FACS分析结果。
1.2.5 Fas mRNA表达的检测 总RNA抽取及逆转录按Gibco试剂盒说明进行。Fas引物序列如下:5'-GATTGCTCAACAACCATGCT-3' 3'-GTTTCGAACCA-GATCTCACT-5'。PCR条件:94℃ 变性3 min,94℃ 1 min,60℃ 1 min,72℃ 1 min,循环35次,72℃ 7 min，同时扩增β-actin为内参照。
2 结果
2.1 抗B7-1单抗和CsA联用诱致抗原特异性的T细胞无能 APC细胞处理TT抗原后，抗B7-1单抗和CsA联用可阻断T细胞的增殖，抗B7-1单抗和CsA单独处理均不能阻断T细胞的增殖。对T细胞分泌IL-2进行了动态检测，结果发现T细胞接受抗原刺激后，IL-2分泌48 h达高峰，抗B7-1单抗和CsA均能抑制IL-2的产生，两者联用可阻断IL-2的分泌(表1)。
2.2 无能T细胞的凋亡的观察 新鲜分离外周血T细胞，以10% FCS 1640维持培养，分别于1、3、5、10 d检测细胞凋亡的情况，发现在不同时相均未发生明显凋亡。无能T细胞在上述时相细胞凋亡的百分率依次为2.16％、11.28%、19.27%、41.22%，表明无能T细胞在体外是逐渐发生凋亡的。当加入100 U/ml IL-2一起培养，无能T细胞未发生明显凋亡。
2.3 不同激活剂对无能T细胞凋亡的影响 外周血T细胞及无能T细胞经激活剂活化诱导后，检测Fas mRNA表达，发现外周血T细胞及外周血T细胞及无能T细胞经PHA激活，再由PHA(10 μg/ml)、PMA+A23187 (各100 ng/ml)和抗CD3单抗(10 μg/ml)活化诱导，24 h可发生凋亡，凋亡的百分率依次为71.91%、31.70%、39.34% 。无能T细胞激活诱导后亦发生凋亡，凋亡百分率分别为34.67％、21.27％、15.07％，其凋亡的程度低于外周血T细胞。
表1 B7-1单抗和/或CsA对TT抗原诱导的T细胞增殖和IL-2产生动力学的影响
Tab.1 Effects of B7-1 mAb and/or CsA on TT-induced T cell proliferation and IL-2 production kinetics
| Group | T cell proliferation
(cpm) |
24 h | IL-2(U/ml)
48 h |
72 h |
| TT control | 2 480±361 | 117±23 | 143±24 | 123±25 |
| B7-1mAb | 1 627±2141) | 35±92) | 41±92) | 37±62) |
| CsA | 1 307±2321) | 31±52) | 33±62) | 29±72) |
| B7-1 mAb+CsA | 128±372) | 0 | 0 | 0 |
| T cell control | 145±41 | 17±6 | 19±8 | 14±5 |
note:1)P＜0.05 2)P＜0.01 compared with TT control2.4 凋亡细胞Fas mRNA的表达 无能T细胞活化诱导后，Fas mRNA均上调表达，正常T细胞及无能T细胞未检测到Fas mRNA表达(图1)，凋亡的外周血T细胞与无能T细胞Fas mRNA表达结果相似。
图1 无能T细胞激活诱导后Fas mRNA的表达
Fig.1 Fas mRNA expression of anergic T cells reactivated by PHA,PMA+A23187 and CD3 mAb at 24 h
Note：1.marker 2.PHA 3.PMA+A23187 4.CD3 mAb 5.anergic T cells
3 讨论
T细胞活化需要两个信号的参与，第一信号由TCR识别APC递呈的MHC-抗原肽所介导，第二信号由多种共刺激分子提供的共刺激信号。Daniel等研究发现转染B7分子的肿瘤细胞，可防止CTL发生凋亡，推测缺失共刺激信号可增加细胞凋亡的敏感性［1］。细胞进行凋亡对于维持体内平衡，免疫系统的正常功能具有重要意义。用CD3单抗或PHA刺激静止T细胞，可促进细胞增殖和细胞因子的分泌，同时可诱导出细胞自杀反应，谓之AICD［5］。对无能T细胞是否发生凋亡尚未见文献报道。
本文研究发现，新鲜分离的外周血T细胞，在不受抗原刺激的情况下，不发生凋亡。当激活剂活化再次诱导刺激后，24 h内便可发生凋亡，表明激活细胞可发生凋亡。我们研究发现无能T细胞在体外是逐渐发生凋亡的，当加入IL-2维持无能细胞未见凋亡，无能T细胞被激活剂活化再次诱导后，可迅速发生凋亡。推断无能T细胞在体内可能通过凋亡而被排除。有报道IL-2可阻止凋亡［6］，亦有相反的报道［7］。我们研究发现外源性IL-2可防止无能T细胞的凋亡。
本文进一步研究了AICD细胞Fas mRNA的表达，发现发生AICD的T细胞Fas mRNA均上调表达，表明Fas/FasL参与这一凋亡过程。有报道发生AICD的T细胞Fas、FasL均上调表达，表明Fas/FasL相互作用是T细胞进行AICD的机制［8，9］。免疫应答启动后，活化T、B细胞Fas表达水平显著增加，并诱导表达FasL，细胞免疫与体液免疫诸多方面均受到Fas调控。表明Fas介导的细胞凋亡对AICD调节的复杂作用。
本课题部分受上海市科技发展基金资助(94JC14005)
作者现通讯地址:中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室406组，上海200031
作者简介：范祖森，男，33岁，讲师，博士后，主要从事自身免疫病和分子免疫学的研究；
马宝骊，女，65岁，教授，博士生导师，主要从事免疫耐受和临床免疫学的研究
4 参考文献
1 Daniel P T，Kroidl A, Sophie C et al. Costimulatory signals through B7-1/CD28 prevent T cell apoptosis during target cell lysis. J Immunol, 1997;159:3808
2 Kawabe Y, Ochi A. Programmed cell death and extrathymic regulation of Vβ8+ CD4+ T cells in mice tolerant to stamulated-lymphocytes aureus enterotoxin B. Nature, 1991;349:245
3 Owen L B, Yonehara B S, Crump W L et al. DNA fragmentation and cell death is selectively triggered in activated human lymphocytes by Fas antigen engagement. Cell Immunol, 1992;140:197
4 Shi Y, Szalay M G, Paskar L et al. Activation-induced cell death in cell hybridomas is due to apoptosis, morphologic aspects and DNA fragmentation. J Immunol, 1990;144:3326
5 Russell J H. Activation-induced of mature T cells in the regulation of immune responses. Curr Opin Immunol, 1995;7:382
6 Nieto M A, Gonzales A, Lopez R F et al. IL-2 protects against anti-CD3-induced cell death in human medullary thymocytes. J Immunol, 1990;145:1364
7 Lenardo M J. Interleukin-2 programs mouse αβT lymphocytes for apoptosis. Nature, 1991;353:858
8 Ju S F, Panka D J, Rothstein A et al. Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T cell activation. Nature, 1995;373:444
9 Brunner T, Mogil R J, Ware C F et al. Cell autonomous Fas(CD95)/FasL interaction mediates activation-induced apoptosis in T cell hybridomas. Nature, 1995; 373:441
〔收稿1998-07-22 修回1998-10-06〕