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超抗原诱导T细胞凋亡或增殖的体外研究①
中国免疫学杂志 1999年第9期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：宋建勋 朱锡华 陈克敏
单位：第三军医大学全军免疫学研究所，重庆400038
关键词：超抗原；T细胞；抗原递呈细胞；细胞凋亡；细胞增殖
摘 要 目的：研究抗原递呈细胞(Apc)在超抗原诱导人外周血特异性T细胞反应中的作用。方法：金黄色葡萄球菌A型肠毒素(SEA)刺激短期人外周血SEA反应T细胞系的作用中，通过去除或加入Apc，观察细胞形态、FCM检测细胞亚G0/G1峰(A0)大小及1.8%DNA琼脂糖凝胶电泳观察凋亡特征条带。结果：SEA 1 μg/ml作用16 h，能明显诱导短期人外周血SEA反应T细胞系凋亡，Apc存在能抑制SEA诱导的T细胞凋亡，细胞处于增殖状态。结论：SEA对作用T细胞的结局(凋亡或增殖)决定于Apc的存在与否。
中国图书分类号 R392.11 R364
In vitro study on T cell apoptosis or proliferation induced by superantigen
SONG Jian-Xun, ZHU Xi-Hua, CHEN Ke-Min.
Institute of Immunology PLA, The Third Miliary Medical University, Chongqing 400038
Abstract Objective:To investigate the effects of Apc on SAg-medicated T cell apoptosis or proliferation.Methods:A short-term SEA-specific T cell lines were established from human peripheral blood and the T cell apoptosis or proliferation induced by SEA in the prescence or absence of Apc were detected by using flow cytometry (FCM) and DNA electrophoresis of 1.8% agarose gel.Results:It was showed that the T cell proliferation in the presence of Apc and the T cell apoptosis in the absence of Apc when the T cell lines induced by SEA 1 μg/ml after 16 h.Conclusion: The T cell outcomes (proliferation or apoptosis)were decided by Apc in the presence or absence induced by SEA.
Key words Superantigen T cells Apc Apoptosis/PCD Proliferation
超抗原(Superantigen, SAg)是一种新型的蛋白质抗原分子，可以在MHCⅡ类分子非限制性辅助下，以TCRVβ特异性的方式激活比普通抗原多达数千倍的CD4+和CD8+T细胞，促使它们增生及分泌细胞因子［1］；然而，SAg在激活大量特异性T细胞之后，常常产生克隆缺失(Clonal deletion)或免疫耐受(Tolerance)而出现无反应性(Anergy)，其机理尚不清楚。许多研究发现，SAg在激活大量特异性T细胞后，可导致激活诱导的细胞死亡(AICD)，即T细胞凋亡，与SAg诱导的T细胞克隆缺失有关［2，3］。SAg主要分为两种，一种是病毒性内源性SAg，如小鼠乳腺肿瘤逆转录病毒(MMTV)产生的蛋白，另一种为细菌性外源性SAg，主要是革兰氏阳性细菌分泌的外毒素，如金黄色葡萄球菌产生的肠毒素(SE)、链球菌产生的致热外毒素等。本研究采用SAg中的SEA诱导人外周血中特异性T细胞系凋亡，观察了Apc在此诱导过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 SEA(1 mg，军事医科院产品)，rIL-2(10 000 U，全军分子免疫学重点实验室产品，批号971027)。淋巴细胞分离液(中国医科院血液研究所，批号970311)；Ficoll(上海试剂二厂，批号970809)。碘化丙啶(PI)、非离子去污剂Triton X-100(Sigma)、蛋白酶K、RNase A、DNA Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)(华美)。
1.1.2 白细胞成分血液标本 重庆西南医院输血科，批号971124-1538。
1.1.3 细胞培养液 10% NCS的RPMI 1640培养液，其中含100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，10 mmol/L HEPES，2 mmol/L L-Gln。
1.2 方法
1.2.1 短期人外周血SEA反应T细胞系的建立 参照文献［4］，略有修改。按常规方法分离人外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC 106 cell/ml，加入SEA 0.5～5.0 μg/ml，37℃，5% CO2的饱和湿度条件下培养3 d，第4天换液，Hank′s溶液离心，洗涤2次，尽可能去除SEA。单核巨噬细胞因粘附在瓶壁，在换瓶培养中可去除。培养液中加入200 U/ml的rIL-2，经过14 d含rIL-2的RPMI 1640完全培养液培养，短时SEA反应T细胞系即可建立。
1.2.2 SEA诱导短期人外周血SEA反应T细胞系凋亡 收集短期人外周血SEA反应T细胞，Hank′s溶液洗涤离心100 g×10 min，细胞用含10%NCS的RPMI 1640完全培养液悬浮，调整密度为5×105 cell/ml，加入24孔平底细胞培养板(Costar)，1 ml/孔，37℃，5% CO2的饱和湿度条件下培养2 h。细胞培养液中加入SEA 1 μg/ml，继续培养。
1.2.3 SEA诱导短期人外周血SEA反应T细胞增殖 同上收集细胞洗涤及培养，只是加入的24孔平底细胞培养板上已有贴壁生长的单核巨噬细胞(102～103细胞，此细胞的获得同1.2.1)，观察细胞生长情况及检测。
1.2.4 短期人外周血SEA反应T细胞凋亡检测 于培养的不同时间(0、2、4、8、16、24、32 h)收集细胞检测。用PI低渗荧光染色液染色(PI 50 μg/ml，枸椽酸钠0.1%，Triton X-100 0.1%)，参照文献［5］，FCM检测亚G0/G1峰大小(A0)，反映已固缩和降解核DNA的细胞数，即凋亡细胞比率。试验2次，取平均值。常规方法提取细胞DNA［6］，1.8%琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA梯状电泳带。
2 结 果
2.1 短期人外周血SEA反应T细胞系的特点 经SEA刺激，rIL-2作用后，PBMC的T淋巴细胞于第4天开始大量增殖，细胞数量明显增多，形成大量聚集在一起的细胞集落，细胞增大，拉长，母细胞化现象明显。SEA刺激后，从第7天开始，细胞出现死亡，数量逐渐增多，死亡细胞主要是B细胞和SEA非特异性T细胞，这与只用rIL-2维持生长而未用SEA刺激的对照PBMC培养中表现相似。至第14 天死亡细胞开始减少，细胞生长与死亡达到平衡状态。SEA反应T细胞系可在体外连续培养40 d左右，在此过程中必须维持IL-2的作用，否则细胞增殖后很快死亡［7］(图1A)。
图1 SEA诱导SEA反应T细胞凋亡的形态(200×)
Fig.1 Morphology of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells(200×)
Note: A. The SEA-specific T-cell lines，B. 8 h treated again by SEA 1 μg/ml
2.2 SEA诱导人外周血短期SEA反应T细胞凋亡 SEA 1 μg/ml诱导同样剂量刺激建立的短期SEA反应T细胞凋亡非常明显。光镜下，作用8 h可观察到部分细胞死亡，作用16 h则出现比较明显的凋亡细胞特征(图1B)。FCM分析亚G0/G1峰(A0)显示，随着诱导时间的延长，凋亡量逐步升高，至作用的第16 h，细胞凋亡量可达58%。SEA反应T细胞(SEA 1 μg/ml使用剂量诱导建立)凋亡量随SEA再次刺激浓度(0.5～6.0 μg/ml)的升高而增加(图2)。1.8%DNA琼脂糖凝胶电泳显示作用16 h呈明显的梯状条带(图3)。
2.3 SEA诱导人外周血短期SEA反应T细胞增殖 在Apc存在情况，SEA(1 μg/ml)的再次作用，能继续促进SEA反应T细胞增殖，光镜下，细胞数量明显增多，形成许多大量聚集在一起的细胞集落。作用16～32 h，FCM检测凋亡细胞数量在(10±5)%的范围内，1.8%DNA琼脂糖凝胶电泳未见梯状电泳条带。
图2 FCM分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡
Fig.2 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells by flow cytometry
Note: A. Dose response of SEA-specific T cells to addition of SEA for 16 h; B. Kinetics of apoptosis induced by SEA( 1 μg/ml) in SEA-specific T cells(established with 1 μg/ml SEA)
图3 DNA琼脂糖凝胶电泳分析SEA诱导SEA反应T细胞凋亡
Fig.3 Analysis of apoptosis induced by SEA in SEA-specific T cells by DNA electrophoresis with 1.8% agarose gel
Note: 1. DNA Marker (λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ) 2. 0 h 3. 16 h 4. 12 h 5. 8 h
3 讨 论
PBMC主要由T、B淋巴细胞和单核细胞组成，SAg可以与单核细胞、B细胞表面的MHCⅡ类分子结合，通过TCRVβ激活大量T细胞。激活的T细胞随后在IL-2的作用下，继续大量扩增。经过2 w左右在IL-2存在的条件下扩增生长，特异性的SAg反应T细胞系即可建立。此时，B细胞与非特异性的T细胞已大量死亡，单核细胞因贴在瓶壁在换瓶培养中可去除。因此，由此建立的短期SAg反应T细胞系主要由SAg特异的T细胞组成。用这种方法建立起来的SAg反应T细胞系在SAg基础和应用研究方面起到重要作用［4，8］。
SAg激活特异性T细胞虽然没有MHC限制性，但是需要MHCⅡ类分子的辅助，即需要有APC的存在。SAg一端与特异性T细胞上的TCRVβ链结合，另一端与APC上的MHCⅡ类分子的非多态区结合，使T细胞表达IL-2受体(IL-2R)，分泌IL-2而增殖。在此过程中，APC上的CD80分子(即B7/BB1)与T细胞上的CD28分子提供协同刺激信号(Costimulatory signal)，明显增强SAg促进T细胞增殖的能力［8］。另外，在无APC存在的情况下，一些辅助分子，如抗CD28 mAb、佛波脂(PMA)、高浓度IL-2的存在下，SAg亦能激活特异性T细胞并使之增殖［9］。
体外试验发现，特异性T细胞在无APC及辅助分子存在的情况下，受SAg的刺激，往往发生PCD。SEB刺激SEB反应T细胞在无APC或MHCⅡ类分子转染细胞存在情况下，T细胞很快凋亡［8］。SEA能诱导SEA反应T细胞凋亡，1 μg/ml SEA诱导同样剂量SEA刺激建立的SEA反应T细胞，在无APC存在时于作用的第16 h，能明显见到细胞凋亡的DNA梯形电泳形态，而在有Apc存在情况下，作用T细胞则增殖。体内试验发现，SEA注入小鼠体内后，首先发生特异性T细胞增殖，随后特异性T细胞PCD，原因是体内缺乏IL-2。移植一个rIL-2泵入小鼠体内，则明显抑制了相关T细胞凋亡。即体内环境中缺少IL-2是SAg诱导特异性T细胞PCD的重要原因［7］。另外，SEB诱导体外激活的人T细胞增殖过程中，当检测到γ-INF受体(尤其是β链)高效表达后，T细胞很快发生PCD，提示γ-INF与SAg诱导的T细胞PCD有关［10］。因此，SAg诱导的特异性T细胞增殖或凋亡与其所处的环境因素有关，尤其是细胞因子(IL-2，γ-INF)及Apc的存在与否。
①全军“九五”医药卫生重点课题，批准号：96Z038
作者简介：宋建勋，男，30岁，讲师，博士；
朱锡华，男，76岁，博士生导师，主要研究分子免疫学
4 参考文献
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2 Ayroldi E, Cannarile L, Ricardi C. Modulation of superantigen-induced T-cell deletion by antibody anti-Pgp-1(CD44) .Immunology, 1996;87(2):191
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〔收稿日期：1998-07-16 修稿日期：1998-10-29