丙肝病毒(HCV)基因免疫实验研究①

丙肝病毒(HCV)基因免疫实验研究①

中国免疫学杂志 1999年第11期第15卷 分子与细胞免疫学

作者：邓　涛　陈乃玲　陈天宝　武珊珊　王孟薇　贾克明

单位：解放军肝病研究所，北京 100700

关键词：丙肝病毒；基因免疫；核酸疫苗

　　中国图书分类号　R322.47　R512.63　R392.1

　　摘　要　目的：探讨HCV核心区基因疫苗在Balb/c小鼠的免疫应答。方法：将与HCV核心区基因互补的cDNA定向克隆于真核表达载体pcDNA3(pcDNA-HCV)，免疫Balb/c小鼠，观测小鼠血清抗-HCV抗体及小鼠脾细胞对HCV核心抗原的特异性增殖反应。结果：5只经皮下注射的免疫鼠中有4只出现抗-HCV抗体，经肌肉注射的免疫鼠全部出现抗体阳转，而对照组全阴性，肌肉注射免疫组抗体水平高于皮下注射免疫组，动态观察发现追加免疫2 w后抗体即可阳转，4～8 w达高峰，可持续12 w以上。免疫组小鼠脾细胞对HCV核心抗原的刺激指数明显高于对照组。结论：pcDNA-HCV在Balb/c小鼠不仅可诱导体液免疫应答，而且可诱导细胞免疫应答。

Plasmid hepatitis C virus core protein:DNA-based immunization for immune responses in Balb/c mice

DENG Tao,CHEN Nai-Ling,CHEN Tian-Bao et al

　　(Institute of Liver Disease ,Beijing 100700)

　　Abstract　Objective：DNA-based immunization has been proved to be an effective means of vaccination in animal models and may be promising candidates as antiviral agents.There is a need to develope new antiviral agents in an attempt to eradicate persistent HCV infection from liver.In this study,the immune responses to HCV core gene DNA-bassed immunization in Balb/c mice were evaluated.Methods：The HCV core gene cDNA(genotype:II)was inserted into the eukaryotic expression vector under the CMV promoter between EcoRI and Xbal I site (pcDNA-HCV).The Balb/c mice were immunized by multiple sites intramuscular or subcutantous injection with pcDNA-HCV.The anti-HCV Ab in serum were detected by ELISA,meanwhile, the proliferative reponses of spleencytes to HCV core antigens were measured by MTT method.Results：The anti-HCV Ab were detected in 4 out of 5 immunized by subcutaneous injection and in all mice immunized by intramuscular injection.Peek titer were reached by 4～6 weeks after immunization and were maintained for at lease 3 months.The stimulation index of spleencytes from mice immunized with pcDNA-HCV to HCV core antigen were significantly higher than that of mice injected with pcDNA3(P＜0.01).Conclusion：The study demonstrated that both humoral and cellular immune responses could be elicited in mice by pcDNA-HCV.Gene immunization can aid the development of HCV vaccines.The pcDNA-HCV might be promising candidates as antiviral agents.

　　Key words　Hepatitis C virus　DNA-based immunization　Gene immunization

　　目前HCV疫苗研究受两大因素制约，首先，HCV体外细胞培养系统尚未建立；其次，HCV至少有6个基因型，而且HCV膜蛋白区具有高度的变异性，易发生免疫逃逸和耐受，采用传统研究方法很难获得对不同HCV株型具有交叉免疫功效的疫苗^［1］。基因免疫，亦称核酸疫苗，既可诱导体液免疫应答，也可诱导细胞免疫应答，这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的HCV感染具有重要意义，而且对慢性病毒感染可能具有治疗作用^［1-3］，本文对HCV高度保守的核心区基因免疫进行了实验研究。

　　1　材料与方法

　　1.1　质粒DNA的构建　从含Ⅱ型HCV核心区基因片段的质粒pTZ19经EcoRI及XbaI双酶切，电泳回收392 bp的含有ATG和TAG的HCV核心区基因片段(cDNA),定向克隆于已预先用EcoRI及 XbaI双酶消化好的真核表达载体pcDNA3(Invitrogene CO.USA)的CMV启动子下游，经氯化钙转化大肠杆菌JM109(北医马大龙教授惠赠)，经LB培养基扩增，按碱裂解法提取质粒，经紫外分光光度计测定浓度，按1　μg/μl溶于无菌PBS，-20℃保存备用。

　　1.2　免疫接种　选用4～6周龄的Balb/c小鼠，用1 ml的OT注射器(25号针头)行双后肢多点肌肉注射及尾部多点皮下注射，肌肉注射深度严格控制在0.2 cm^±。每只小鼠注射总量100 μg，为加强免疫，2 w后追加免疫1次。实验中设对照组，注射等量空白质粒pcDNA3。

　　1.3　血清收集及抗HCV抗体检测　采用割尾或眼眶静脉丛穿刺连续采血，每次采血量0.3～0.5 ml，离心收集上清置-20℃冰箱，一次性检测。用酶联免疫试验(ELISA)检测血清抗-HCV抗体，试剂盒购自北京生物制品研究所，二抗为羊抗鼠IgG，按试剂盒说明进行检测。

　　1.4　T细胞抗原特异性增殖反应测定　通过摘眼球放血处死肌肉免疫组小鼠，制备小鼠脾细胞悬液，细胞浓度为1×10⁶ml^-1，加入96孔板，每孔100μl，平行3孔，分别加入HCV核心抗原(HCVcAg)5 μg/孔，37℃、5%CO₂，孵育72 h，加MTT10μl、37℃、6h，再加盐酸异丙醇100μl/孔，混匀，静置15 min，测各孔A570值，计算增殖指数。增殖指数=实验组OD值/对照组OD值^［4］ 。

　　2　结果

　　2.1　pcDNA-HCV质粒的鉴定　pcDNA-HCV经EcoRI和XbaI双酶切后，电泳可见392 bp(见图1)的条带，而空载质粒 pcDNA3则无此条带，证明HCVcore基因已被插入pcDNA-HCV。

图1　pcDNA-HCV，ptz19的限制性内切酶图谱分析

　　Fig.1　Restriction analysis of pcDNA-HCV,ptz19

　　Note:1.DNA standard:PBR322DNA/BstNI;2.pcDNA3 cut by EcoRI/XbaI;3.pcDNA-HCV cut by EcoRI/XbaI;4.ptz19 cut by EcoRI/XbaI

　　2.2　血清抗-HCV抗体检测结果　5只经皮下注射的免疫鼠中有4只出现抗-HCV抗体，5只经肌肉注射的免疫鼠全部出现抗体阳转，而对照组全阴性，抗体水平及动态改变见图2、3，同样肌肉免疫注射组高于皮下注射组，加强免疫后2 w出现抗-HCV，4～8 w达高峰，可持续12 w以上。而注射空载质粒的对照组无1只抗-HCV抗体阳性。

图2　基因免疫小鼠血清抗-HCV抗体水平

　　Fig.2　Comparison of antibody response in mice immunized using different methods

　　Note：1～5 means the codes of the mice

图3　pcDNA-HCV基因免疫Balb/c小鼠抗-HCV抗体动态改变

　　Fig.3　Kinetics of apperance of anti-HCV Ab in sera from mice injected with pcDNA-HCV.Sera were used at a 1∶20 dilution

　　Note:No.1～5 means the mice's codes of the muscular group

　　2.3　T细胞抗原特异性增殖反应　T细胞抗原特异性增殖反应见图4，可见pcDNA-HCV经肌肉注射

　　免疫小鼠后对HCVAg增殖反应明显高于对照组，增殖指数为1.527，明显高于对照组(P＜0.01)。

图4　免疫Balb/c小鼠脾细胞对HCV核心抗原的增殖反应结果

　　Fig.4　The results of proliferation response of T cell from mice immunized by intramuscular injection to HCV core Ag

　　Note:(1)=pcDNA3 immunization group (No antigen stimulation):(2)=pcDNA3 immunization group(HCV antigen stimulation )(3)=pcDNA-HCV immunization group (No antigen stimulation):(4)=pcDNA-HCV immunization group (HCV antigen stimulation )1、2、3、4、5 means the mice's codes

　　3　讨论

　　基因免疫是近年发展起来的新型生物技术，其先进的理论构想和众多的动物实验初步表明，DNA疫苗具有众多优点：不仅可诱导体液免疫应答，而且可诱导细胞免疫应答；抗原蛋白的空间构象与天然蛋白更接近，免疫原性更强。

　　基因免疫的作用机制尚不清楚，其抗原呈递可能存在以下三种途径：①肌纤维细胞被质粒DNA转染，表达的抗原蛋白在肌纤维细胞内被加工后形成小分子抗原多肽，继而与肌纤维细胞内的MHC-I分子结合，激活T淋巴细胞；②肌肉组织中的抗原呈递细胞如树突状细胞(dendritic cells)在免疫接种过程中可能被质粒DNA转染而进行抗原呈递；③抗原蛋白从肌细胞分泌出来后，被树突状细胞吞噬处理，然后与MHC-Ⅱ分子结合，激活T细胞、B细胞。

　　HCV具有多个基因型，其中和抗体位点所在膜区(E)呈高度变异性，机体感染HCV后易发生免疫耐受，因此，采用传统的疫苗研究方法，难以获得对不同HCV株型同时具有预防功效的疫苗。要克服这种免疫耐受现象，就必须避开高变区，选择相对保守区进行实验，同时诱导机体产生体液免疫应答及对预防不同株型病毒感染具有重要作用的细胞免疫应答。Saito等研究发现，用HCV E区基因免疫难以诱导有效的细胞免疫应答^［5］，因此，本文选用在我国常见的Ⅱ型HCV的高度保守区(核心区)进行免疫实验研究，结果显示经皮下或肌肉注射pcDNA-HCV均可诱导体液免疫应答，肌肉注射优于皮下注射，经多点肌肉注射还可在小鼠体内诱导特异性的细胞免疫应答，与Saito和Tokushige等研究结果类似^［6］，但本文例数少，仅为初步结果，尚待深入研究。HCV感染慢性化的重要原因之一是机体特异性细胞免疫应答功能低下，不能有效清除HCV感染的肝细胞^［7］，因此，这种特异性的细胞免疫应答不仅对预防不同株型的HCV感染具有重要意义，而且对慢性HCV感染患者可能具有治疗作用，有望成为慢性丙型肝炎患者一种理想的免疫治疗措施。

　　①本课题受国家自然科学基金资助(39770660)

　　作者简介：邓　涛，男，33岁，博士研究生，主治医师，主要从事病毒性肝炎研究

　　4　参考文献

　　1　Simonds P,Holmes E C,Cha T A et al. Classification of hepatitis C Virus into six major genotyes and a series of subtypes by phylogenic analysis of the NS5 region.J Gen Virol,1993;74:2391

　　2　邓　涛，陈乃玲，贾克明.病毒核酸疫苗的研究现状.国外医学*病毒学分册，1996；3(3)：88

　　3　邓　涛，陈乃玲，贾克明.HBV及HCV基因免疫的研究现状.国外医学*传染病学分册，1997；24(3)：111

　　4　Tim M.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxity assays.J Immunol Methods,1983;65:55

　　5　Saito T,Sherman G J,Kurokhchi K et al.Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins:immune responses in mice.Gastroenterology,1997;112:1321

　　6　Tokushige K,Wakita T,Pachuk C et al.Expression and immmune response to Hepatitis C Virus Core DNA-based Vaccine constructs.Hepatology,1996;24:14

　　7　Schulz M,Zinkernagel R M,Hengartner H et al.Peptide-induced antiviral protection by cytotoxic T cells.Proc Natl Sci USA,1991;88:991

收稿1998-04-15　修回1998-05-14