SLE患者TCR Vβ基因亚家族的表达特征及其克隆性①

SLE患者TCR Vβ基因亚家族的表达特征及其克隆性①

中国免疫学杂志 1999年第11期第15卷 临床免疫学

作者：陈红清　李扬秋　黄树林　徐文严

单位：陈红清　徐文严　中国医学科学院皮肤病研究所， 南京 210042；李扬秋　暨南大学医学院血液病研究室，广州510632；黄树林　广东药学院分子生物学研究室（指导老师），广州510224

关键词：系统性红斑狼疮；TCR Vβ基因；T细胞克隆性

　　中国图书分类号　R593.24　R392.11

　　摘　要　目的：探讨SLE患者外周血淋巴细胞中TCR Vβ基因亚家族的表达及其克隆性。方法：采用RT-PCR-Southern杂交分析TCR Vβ 1～20基因亚家族的表达水平，进而用RT-PCR扩增TCR Vβ 24个亚家族的CDR3，并经基因扫描分析确定T细胞的克隆性。结果：6例SLE患者Vβ 8和Vβ 16的表达明显增高， 2例患者的Vβ 2和Vβ 9产物来源于寡克隆T细胞。结论：在自身抗原刺激下，TCR Vβ基因存在着优势取用； T细胞的克隆性增殖则可能是由特定的自身抗原所引起的应答。

Characteristics of TCR Vβ gene subfamily expression and T cell clonality in patients with systemic lupus erythematosus

CHEN Hong-Qing, LI Yang-Qiu, HUANG Shu-Lin et al

　　(Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Nanjing 210042)

　　Abstract　Objective：To investigate the TCR Vβ gene subfamily expression and T cell clonality in patients with Systemic lupus erythematosus (SLE).Methods：The level of TCR Vβ gene expression was analyzed using RT-PCR and Southern blotting. CDR3 regions of TCR Vβ 1～24 gene were amplified by RT-PCR, then analyzed by Genescan in order to determine the T cell clonality. Results：Significant increases were found in the level of expression of Vβ 8 and Vβ 16 gene , Morever ,Vβ 2 and Vβ 9 products were derived from oligoclonal T cells.Conclusion：The results suggested that the usage of TCR Vβ gene was restricted when stimulated by some autoantigens and that the clonal expansions of T cells may be a specific autoantigen-driven response.

　　Key words　Systemic lupus erythematosus　TCR Vβ gene　 T cell clonality

　　系统性红斑狼疮（SLE)患者多伴有细胞及体液免疫异常， 最终导致自身抗体的产生。在细胞免疫异常中，T细胞的作用显得更为重要，因为T细胞能调节B细胞的功能，而且在SLE中大多数致病性自身抗体是T细胞依赖性的^［1］。T细胞受体（TCR)是T细胞识别抗原及被激活的中心环节，TCR的选择性表达可能与某些炎症性风湿病的免疫发病机理有关^［2］。TCR β基因有47个有功能的V基因片段，根据核苷酸顺序同源性大于等于75%的原则，其分属26个家族^［3］。本研究对SLE患者的TCR Vβ基因亚家族的表达特征及其克隆性进行了分析。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　 10例SLE患者全部为女性，年龄为18～38岁，均符合美国风湿病学会1982年修订的诊断标准，正常对照8例。

　　1.2　方法　外周血淋巴细胞分离、RNA提取及逆转录合成cDNA参见文献［4］。RT-PCR及Southern杂交检测TCR Vβ基因亚家族的表达亦参见文献［5］。

　　1.2.1　RT-PCR　根据TCR Vβ 24个亚家族基因设计出相应的24个Vβ特异性上游引物，并在Cβ区设一Cβ下游引物，另外还在Cβ引物的左侧设一荧光素标记的Cβ-FAM引物（Cβ-Fam 5'-Fam-CACAGCGACCTCGGGTGGG）供基因扫描之用^［6］。PCR的总反应体积为25 μl,其中含1 μl cDNA, 0.1 mmol/L dNTP, 引物浓度均为0.5 μmol/L（任一Vβ和Cβ引物），1.25 U Taq DNA聚合酶，共进行40个循环：94℃ 1 min（首次3 min）；60℃ 1 min；72℃ 1 min（末次10 min）；反应结束后保存于4℃中，各反应均设阳性和阴性对照，扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

　　1.2.2　标记PCR产物　 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析发现阳性带者继而以Cβ-Fam为引物进行不对称PCR扩增，以得到荧光素标记的单链PCR产物，总反应体积为10 μl，包括2 μl首次PCR产物，0.1 μmol/L Cβ-Fam, 3 mmol/L MgCl₂, 0.2 mmol/L dNTP, 0.25 U Taq DNA聚合酶，反应共进行35个循环：94℃ 1 min；66℃ 1 min；72℃ 1 min（末次10 min）。

　　1.2.3　基因扫描分析T细胞克隆性　经标记PCR反应后得到的产物1 μl，加入2.5 μl甲酰胺，0.5 μl标准品（ABI, Genescan 500-Tamra,其中含有不同大小的荧光素标记的DNA片段）及0.5 μl加样缓冲液（含葡聚糖蓝50 mg/ml和EDTA 25 mmol/L），94℃变性4 min后于6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用373A DNA序列分析仪（Perkin Elmer公司）分析结果，通过分析软件GeneScan672、激光扫描及计算机收集电泳过程中不同时间所出现的不同强度和颜色的荧光素而显示出不同的位置、高度、颜色和形态的峰。荧光素Fam 呈蓝色而Tamra则呈红色，峰的位置表示产物的大小（与标准品相比），高度表示产物的量，而形态则代表产物的均一性，若所含的DNA片段大小相同，则其基因扫描结果表现为单峰；若绝大多数DNA片段大小相同，则呈一主峰及个别矮峰；若产物中DNA片段大小不一，其基因扫描结果就呈多峰图象，这三者分别提示产物来自单克隆、寡克隆和多克隆T细胞。

　　2　结果

　　2.1　分离6例SLE患者外周血淋巴细胞，采用RT-PCR-Southern杂交分析TCR Vβ 1～20基因亚家族的表达特征，发现其均表现为Vβ 8和Vβ 16表达水平增高，见图1和表1。

　　2.2　T细胞克隆性的分析，采用Vβ 1～-24/ Cβ引物进行RT-PCR扩增后，5例正常人外周血表达除Vβ 20外的其他Vβ亚家族T细胞；4例SLE患者外周血淋巴细胞检测结果为：例1表达Vβ 2、Vβ 3；例2表达Vβ 2；例3表达Vβ 9；例4则表达Vβ 2。进而将这些阳性产物用基因扫描分析后发现6例正常人全部PCR产物均呈多峰图象，提示产物大小不一，即来自不同克隆的T细胞（多克隆）；例1、例2所表达的Vβ产物亦为多峰图象，即来自多克隆T细胞；而例3所表达的Vβ 9产物和例4表达的Vβ 2产物则呈一主峰及个别矮峰图象，即来自寡克隆T细胞，如图2所示。

图1　TCR Vβ 1-20基因亚家族在正常和SLE患者淋巴细胞中的表达

　　Fig.1　TCR Vβ 1-20 gene subfamily expression in peripheral blood lymphocytes from healthy controls and patients with SLE

表1　6例SLE患者TCR Vβ 1-20 基因亚家族表达水平（%）

　　Tab.1　Levels of TCR Vβ 1-20 gene subfamily expression in peripheral blood lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus by semiquantitative RT-PCR and Southern blotting(%)

Vβ	Healthy	1	2	3	4	5	6
	controls
1	3.34	5.45	1.40	3.36	3.22	6.95	0.36
2	1.19	4.38	4.29	2.94	6.22	3.99	2.27
3	8.00	2.28	0.64	0.54	0.64	2.11	0.11
4	1.45	5.76	3.99	5.12	4.71	4.55	3.96
5.1	1.87	0.87	0.48	0.09	1.01	0.41	0.05
5.2	1.41	4.03	2.99	3.74	4.35	3.19	2.85
6	7.27	0.51	1.27	0.67	1.91	0.82	0.60
7	7.28	0.00	1.36	1.67	3.08	1.42	0.51
8	3.97	16.97	17.05	13.61	10.53	12.46	16.05
9	5.20	0.76	0.85	1.33	0.53	1.35	0.30
10	8.01	1.14	1.72	1.38	2.89	2.21	1.69
11	4.34	0.79	0.31	0.22	1.08	0.49	0.45
12	2.78	1.00	0.44	1.60	0.97	1.52	0.34
13.1	5.82	0.99	1.60	0.62	0.53	0.88	1.14
13.2	1.23	3.82	3.33	2.46	4.02	2.89	3.51
14	8.00	0.51	0.37	0.46	0.90	0.78	0.80
15	7.36	1.49	0.86	1.31	2.15	2.96	0.51
16	2.00	44.46	51.77	51.07	38.02	42.53	55.41
17	1.76	0.80	1.11	1.61	1.65	1.56	0.39
18	3.27	0.91	1.38	1.92	3.21	1.76	2.20
19	7.06	0.96	1.33	1.83	2.64	0.85	4.12
20	7.38	2.13	1.45	2.43	3.73	4.32	2.39

图2　4例SLE患者的外周血淋巴细胞TCR Vβ扩增产物 的基因扫描分析结果

　　Fig.2　Amplified products of TCR Vβ gene in the peripheral blood lymphocytes from four patients with SLE analyzed by Genescan software

　　3　讨论

　　在SLE患者和狼疮鼠中的研究表明，能诱导B细胞产生致病性自身抗体的T细胞为CD4⁺αβ T辅助性细胞，其所表达的TCR则具有异质性，仅表达Vγ 1、Vδ 5、 Vδ 1及Vδ 3，而针对snRNP抗原的T细胞克隆则表达Vβ 1、Vβ 3、Vβ 5.2、Vβ 6及Vβ 14^［7］，本研究利用RT-PCR和Southern杂交技术对6例SLE患者的TCR Vβ 1～20基因亚家族的表达进行了分析，结果发现这些患者外周血淋巴细胞中Vβ 8和Vβ 16的表达水平明显增高，说明在自身抗原的刺激下，TCR V基因存在着优势取用。有意义的是，Furukawa等在慢性皮肤型红斑狼疮患者的皮损中亦发现表达有Vβ 8和Vβ 13的T细胞发生选择性扩增^［8］，所以Vβ 8⁺ T细胞有可能是SLE患者外周血中的优势克隆，至于其是否为非胸腺来源的TCR^int细胞尚有待进一步研究，因为TCR^int细胞中约有60%以上为Vβ 8⁺细胞，其所具有的自身反应性，对自身免疫病的发病可能有一定的促进作用。

　　T细胞克隆性分析主要是利用Vβ基因亚家族和CDR3的特点，即不同克隆T细胞的TCR发生重排时，由于在其V-D、D-D、D-J或V-J连接区被若干个核苷酸间隔开，所以其CDR3的长度与碱基序列均有所不同，这样就在基因扫描图上表现出不同的峰形。本研究通过基因扫描分析发现有2例患者的Vβ 2.0和Vβ 9.0产物来源于寡克隆T细胞，这种克隆性增殖的T细胞可能是特定的自身抗原所引起的一种特异性应答，Sutmuller等也认为Vβ 2在狼疮性肾炎的发病中起一定作用^［9］，因此有必要对这些Vβ亚家族在SLE的免疫发病机理中的作用进行深入的探讨。

　　本研究采用RT-PCR和基因扫描技术证实了在SLE患者外周血淋巴细胞中TCR Vβ基因存在着优势取用，而且某些T细胞呈寡克隆增殖，这些结果使我们对SLE的免疫发病机理有了更进一步的认识，在此基础上可利用针对自身反应性T细胞上的特定TCR的抗体或TCR多肽来去除或抑制这些致病性T细胞克隆以达到治疗和预防的目的。

　　①中华医学会皮肤科学会诺华研究基金资助

　　作者简介：陈红清，男，32岁，博士生，讲师，主要从事SLE的免疫发病机理的研究,现在广东医学院皮肤性病研究所工作

　　4　参考文献

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　　2　栗占国，Manolios N, 施桂英. T细胞抗原受体在风湿病中的作用. 中华内科杂志，1994；33（1）：54

　　3　孙　玮，王福庆. 人T细胞受体基因的命名.上海免疫学杂志，1997；17（1）：9

　　4　黄树林，明文玉，罗利琼 et al. HSV-2感染人外周血淋巴细胞后TCR Vβ基因片段的选择性扩增.上海免疫学杂志，1997；17（2）：98

　　5　Dunn D A, Gadenne A S, Simha S et al. T-cell receptor Vβ expression in normal skin. Proc Natl Acad Sci USA, 1993; 90(3): 1267

　　6　Puisieux I, Even J, Pannetier C et al. Oligoclonality of tumor-infiltrating lymphocytes from human melanomas. J Immunol, 1994; 153: 2807

　　7　Tsokos G C. Lymphocytes, cytokines, inflammation, and immune trafficking. Curr Opin Rheumatol, 1996; 8(5):395

　　8　Furukawa F, Tokura Y, Matsushita K et al. Selective expression of T cells expressing Vβ 8 and Vβ 13 in skin lesions of patients with chronic cutaneous lupus erythematosus. J Dermatol, 1996; 23: 670

　　9　Sutmuller M, Baelde H, Ouelltte S et al. T-cell receptor Vbeta gene expression in experimental lupus nephritis. Immunol, 1998; 95(1): 18

收稿1999-02-02　二次修回1999-07-29