人肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨①

人肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨①

中国免疫学杂志 1999年第11期第15卷 肿瘤免疫学

作者：王正昕　曹雪涛　张明徽　李　楠　王元和

单位：王正昕　王元和第二军医大学附属长征医院普外科，上海 200003；曹雪涛　张明徽　李　楠　第二军医大学基础医学部免疫学教研室，上海200433

关键词：树突状细胞；肿瘤浸润；MHC-II类分子；IL-10；VEGF；TGF-β1；免疫抑制

　　中国图书分类号　R73-3

　　摘　要　目的：树突状细胞作为抗原提呈细胞在机体的抗肿瘤免疫反应中起重要作用，对肿瘤浸润性树突状细胞的研究有助于揭示肿瘤免疫逃逸机制。方法：采用酶消化、细胞分离、流式细胞仪分析等方法研究了14例胃肠道肿瘤患者肿瘤浸润性树突状细胞的表型，并用RT-PCR检测了IL-10、VEGF和TGF-β₁3种免疫抑制因子在14例肿瘤细胞中的表达。结果： 肿瘤浸润性单核细胞中有CD1a^＋的树突状细胞存在，该类细胞的表面分子如MHC-II类分子、CD80及CD54等共刺激分子和粘附分子有低表达或不表达，14例肿瘤细胞中IL-10、VEGF及TGF-β₁的表达率均较高。结论：肿瘤浸润性树突状细胞可能是一种无功能或功能低下的树突状细胞，肿瘤细胞在肿瘤局部分泌的免疫抑制因子可能是导致肿瘤浸润性树突状细胞功能低下的原因之一。

The phenotypes of human tumor infiltrating dendritic cells

　　in gastrointestinal cancers

WANG Zheng-Xin,CAO Xue-Tao,ZHANG Ming-Hui et al

　　(Department of Immunology of Second Military Medical Uiniversity,Shanghai 200433)

　　Abstract　Objective： As antigen-presenting cells,dendritic cells(DCs) p?ay important roles in antitumor immune response.Analysis of tumor infiltrating dendritic cells(TIDCs)would contribute to investigate the mechanisms by which tumors escape immune recognition.Methods：Phenotypes of TIDCs were examined by methods including digestion with enzyme，cell separation and FACS.Reverse transcript-polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect IL-10、VEGF and TGF-β₁ mRNA expression in the freshly isolated tumor cells of 14 patients.Results：The expression of some molecules such as MHC class II and costimulating factors(CD80)，adhesion molecules(CD54)on the surface of TIDCs were downregulated or negative .Levels of IL-10、VEGF and TGF-β₁ mRNA expression in tumor cells of 14 patients were very high.Conclusion：The results suggested that TIDC was a kind of dysfunctional DC and immunosuppressive factors from tumor cells could inhibit DC's function .

　　Key words　Dendritic cells　Tumor infiltration　MHC class II　IL-10　VEGF　TGF-β₁　Immunosuppression

　　树突状细胞（Dendritic cell,DC）是目前已知机体内功能最强的抗原提呈细胞，能在体内外直接激活静息期T细胞，促进T辅助细胞和CTL的生成。近年来关于DC在肿瘤免疫治疗中的作用研究引人注目，取得了一系列进展^［1］。但是对肿瘤微环境中浸润性DC的功能状态的研究很少，而对这部分DC的研究有助于揭示肿瘤免疫逃逸的机制。本文通过对5例胃癌、9例结直肠癌肿瘤组织中浸润性细胞的研究，证实了肿瘤浸润性树突状细胞（Tumor　infiltrating dendritic cell ,TIDC）的存在，并通过流式细胞仪检测TIDC的表型，且用RT-PCR的方法检测IL-10、VEGF及TGF-β₁在14例肿瘤细胞中的表达。本结果提示肿瘤细胞局部产生的免疫抑制因子IL-10、VEGF及TGF-β₁可能是导致TIDC无功能或功能低下的原因之一。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　标本来源　胃癌标本5例,大肠癌标本9例,病理证实均为腺癌,其中直肠癌5例,结肠癌4例,标本均取自上海长征医院普外科。获瘤体重量4.40～8.10g，平均6.03g。患者年龄45～71岁，平均57.5岁，男8例，女6例。

　　1.1.2　主要试剂　胶原酶IV型，DNA酶I型，透明质酸酶V型，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液（Histopaque，1.077g/ml）购自Sigma公司;FITC标记的抗人CD1a、抗人HLA-DR单克隆抗体、PE标记的抗人CD86、抗人CD80单克隆抗体、抗人CD54、抗人CD14单克隆抗体、同亚型对照抗体及FITC标记兔抗鼠IgG荧光二抗均购自PharMingen公司。完全培养基包括：RPMI1640，10％小牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，0.01mmol/L丙酮酸钠，0.05 mmol/L 2-巯基乙醇，20mmol/L Hepes，1 000U/ml青霉素，链霉素1 000μg/ml,甲硝唑5μg/ml。

　　1.2　方法

　　1.2.1　取材　标本切下后，纵向打开肠腔，0.05％洗必泰反复冲洗，切取1/3～1/2肿瘤组织，置于培养皿中称量。然后肿瘤组织块浸于含青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640中30min。

　　1.2.2　单细胞悬液的制备　将瘤体剪成1 mm³大小，置于含0.05%胶原酶、0.02%DNA酶、0.01%透明质酸酶、10%小牛血清的RPMI1640培养基中，4℃磁力搅拌过夜消化，再经200目钢网过滤，收集所有单细胞悬液，经Hank液洗2遍，调整细胞浓度至1×10⁶ ml^-1左右。

　　1.2.3　 细胞分离及流式细胞仪分析　向离心管中依次加入比重为1.077 g/ml和1.055 g/ml的淋巴细胞分离液各2 ml，再在上面加入2～3 ml单细胞悬液，400 g离心20 min，收集处于上层界面的肿瘤细胞，Hank液洗，－70℃冻存；收集2层淋巴细胞分离液界面上的细胞悬液，Hank液洗，置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，5%CO₂ 37℃过夜培养。收集悬浮细胞，用FACS标记液PBA（PBS＋1%BSA＋0.02%叠氮钠）调整细胞浓度为5×10⁶　ml^-1，加入离心管，100 μl/管，分别按直接标记法或间接标记法进行标记，流式细胞仪（FACS calibur,B.D.公司）检测细胞表面表型。

　　1.2.4　肿瘤细胞表达免疫抑制因子的RT-PCR检测　取分离冻存的肿瘤细胞，以TRIZOL提总RNA，用AMV作反转录，引物为oligo-dT15，反转录产物作为PCR的模板分别检测VEGF、IL-10及TGF-β₁的表达。引物序列分别为IL-10：上游5'ACAGCTCAGCACTGCTCTG，下游5'AGTTCACATGCGCCTTG；VEGF：上游5'TTGCTGCTCACCTCCAC，下游5'AATGCTTCTCCGCTCTG；TGF-β₁：上游5'CCCTGGACACCAACTATTG，下游5'GTTGGCATGGTAGCCCT。PCR反应条件均为95℃，15 s；55℃，30 s；72℃，30 s；35个循环。同法作正常胃、结肠、直肠粘膜组织中免疫抑制因子的表达。

　　2　结果

　　2.1　 TIDC的表型分析　对5例胃癌、4例结肠癌、5例直肠癌肿瘤组织中所分离的浸润性淋巴细胞群的FACS分析结果表明，10例有CD1a⁺、CD86^＋表达的细胞存在（见表1），占分离的淋巴细胞数的4.62%±2.89%，细胞活力＞80%，且该群细胞除有4例低表达HLA-DR外均不表达HLA-DR，CD54和CD80的表达率也很低，且都不表达CD14（见表1）。

　　2.2　肿瘤细胞表达免疫抑制因子的检测　通过RT-PCR检测了上述14例新鲜分离的肿瘤细胞表达免疫抑制因子的情况，发现IL-10 mRNA的表达率为92.8%，VEGF mRNA的表达率为71.4%，TGF-β₁ mRNA的表达率为64.3% (见表2、图1)，而正常粘膜组织中除直肠粘膜有VEGF mRNA和IL-10 mRNA的弱表达外，结肠和胃粘膜中均无表达，且3种粘膜组织中均未检测到TGF-β₁ mRNA的表达（未列入）。

表1　14例肿瘤患者TIDC的表型特征

　　Tab.1　 The phenotypes of tumor infiltrating dendritic cells of 14 patients

Tumor	Classification	CD1a	CD86	CD80	HLA-DR	CD54
Colon	Duckes'B	+	+	+	-	+
Rectal	Duckes'C	-	-	-	-	-
Rectal	Duckes'A	+	+	-	-	-
Colon	Duckes'A	+	+	-	-	-
Rectal	Duckes'C	+	+	-	-	-
Gastric	IV	-	-	-	-	-
Gastric	III	+	+	-	+	-
Gastric	IV	-	-	-	-	-
Colon	Duckes'C	+	+	-	+	-
Gastric	IV	-	-	-	-	-
Rectal	Duckes'A	+	+	+	-	+
Rectal	Duckes'A	+	+	-	+	-
Rectal	Duckes'A	+	+	-	-	-
Gastric	I	+	+	-	+	-

表2　IL-10、VEGF及TGF-β₁在14例人肿瘤细胞中的表达率

　　Tab.2　Positive rates of IL-10，VEGF and TGF-β₁ mRNA expression in tumor cells of 14 patients

	Total patients	Patients of positive expression	Positive rates
IL-10	14	13	92．8％
VEGF	14	10	71．4％
TGF-β1	14	9	64．3％

图1　IL-10、VEGF及TGF-β₁ mRNA在人肿瘤细胞中的表达

　　Fig.1　The expression of IL-10，VEGF and TGF-β₁ mRNA in human tumor cells

　　Note:1. gastric cancer ;2. rectal cancer ;3. colon cancer

　　3　讨论

　　DC是目前已知体内功能最强的抗原提呈细胞。我们通过细胞分离的方法对胃肠道TIDC的表面分子的表达进行了分析，实验结果表明，14例病例中有10例肿瘤组织分离的浸润细胞中有CD1a^＋、CD86^＋表达的细胞存在，该群细胞数量很少，约占分离得到的淋巴细胞数的4.62%±2.89%。该群细胞除4例低表达HLA-DR外，其余均不表达HLA-DR，且CD54和CD80的表达率也很低。4例无CD1a^＋、CD86^＋TIDC浸润的患者，肿瘤的病理分期皆为III、IV期的患者，说明TIDC的浸润与病变的恶性程度关系密切，这与以往用免疫组化的方法对TIDC的研究结果相一致^［2，3］。TIDC的表面分子HLA-DR 、CD54和CD80的不表达或低表达具有重要意义。MHC-II类分子与外源性抗原的提呈关系密切，MHC-II类分子的不表达或低表达说明DC提呈外源性抗原的能力低下，而且DC对抗原多肽的提呈还需要其表面表达的共刺激分子、粘附分子的参与，TIDC表面的CD80、CD54的低表达或不表达同样可以导致DC的抗原提呈能力低下，这可能是TIDC无法有效诱导抗原特异性CTL反应的原因之一。因此我们认为TIDC是一种无功能或功能低下的DC，即使有大量的肿瘤浸润性淋巴细胞（Tumor infiltrating cells,TIL）存在，也无法有效地识别和杀伤肿瘤细胞。至于造成TIDC功能障碍的原因，目前多数学者认为是肿瘤细胞释放的免疫抑制因子作用于DC所致，导致其表面分子的表达和功能发生变化^［4］。

　　IL-10、VEGF及TGF-β₁均为免疫抑制因子，能够抑制抗原提呈细胞的免疫功能。Allavena等研究表明IL-10能降低DC的表面分子如MHC-II、CD80及CD86等的表达率，抑制DC的分化成熟，抑制DC的抗原提呈能力^［5］。而IL-10的分泌又受TGF-β的影响，TGF-β的存在可显著促进IL-10的分泌，应用抗体阻断法证实TGF-β对抗原提呈细胞功能的影响是通过IL-10实现的，而且TGF-β₁可下调MHC-II类分子的表达^［6］。VEGF是一种34～42　kD的蛋白，可在DC成熟过程的早期影响造血前体细胞分化为功能成熟的DC^［7］。我们的实验结果表明IL-10、VEGF及TGF-β₁mRNA在肿瘤细胞中都有很高的表达水平，而在正常胃肠道粘膜组织中的表达水平很低或无表达，说明肿瘤局部有大量的肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子存在，这些免疫抑制因子单独或相互作用可能是造成TIDC表面的MHC-II类分子、共刺激分子（CD80）及免疫粘附分子（CD54）低表达或不表达的原因之一，致使TIDC的功能障碍，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸。

　　综上所述，我们的实验结果提示TIDC是一种无功能或功能低下的DC，肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子IL-10、VEGF及TGF-β可能是导致其某些表面分子低表达或不表达的原因之一，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸，进一步研究肿瘤微环境中TIDC表型及功能状态变化的原因，有助于深入认识肿瘤免疫逃逸机制。

　　①本课题受国家自然科学基金重点项目（39730420）和国家杰出青年科学基金（39835123）资助

　　作者简介：王正昕，男，31岁，普外科博士生；

　　曹雪涛，男，36岁，教授，博士生导师，教研室主任，《中国免疫学杂志》编委，《中国肿瘤生物治疗杂志》常务副主编，主要从事肿瘤免疫学研究

　　4　参考文献

　　1　曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究进展.中国免疫学杂志,1998； 14(3): 161

　　2　Ambe K,Mori M,Enjoji M.S-100 protein-pensitive dendritic cells in colorectal adenocarcinomas. Cancer, 1989； 63: 496

　　3　Tsujitani S , Kakeji Y, Watanabe A et al. Infiltration of dendritic cells in relation to tumor invasion and lymph node metastasis in human gastric cancer . Cancer , 1990； 66: 2012

　　4　王正昕，曹雪涛.肿瘤浸润性树突状细胞的研究进展.国外医学*免疫学分册，1998；21(6)：326

　　5　Allavena P, Piemonti L, Longoni D et al. IL-10 prevents the differen-tiation of monocytes to dendritic cells but promotes their maturation to macrophages. Eur J Immunol,1998;28:359

　　6　D'Orazio T J,Niederkorn J Y. A novel role for TGF-β and IL-10 in the induction of immune privilege. J Immunol,1998;160:2089

　　7　Oyama T, Ran S, Ishida T et al. Vascular endothelial growth factor affects dendritic cell maturation through the inhibition of nuclear factor-kB activation in hemopoietic progenitor cells. J Immunol,1998;160:1224

收稿1999-04-20　修回1999-08-20