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肿瘤坏死因子β诱导淋巴细胞化学发光及其增殖的研究
中国免疫学杂志 1999年第12期第15卷 肿瘤免疫学
作者：俞越汉 丁鸣 马志章 王君晖 钱凯先 丁仁瑞
单位：浙江大学生命科学院免疫工程实验室，杭州310012
关键词：重组人肿瘤坏死因子β；淋巴细胞；化学发光；顺磁共振
摘 要 目的:探讨活性氧参与rhTNFβ诱导淋巴细胞活化作用的机理。方法：采用化学发光(CL)和顺磁共振法(ESR)研究rhTNFβ诱导人外周血淋巴细胞产生活性氧(OR)的动态变化及其增殖作用。结果：①用10～2 000 U/ml的rhTNFβ处理1×106 ml-1淋巴细胞均可诱发Ly-CL,其中以100 U/ml rhTNFβ处理18～20 min的CL峰值(RLI)为最高，所诱发的OR主要为OH·；②以15～62 U/ml的rhTNFβ处理淋巴细胞72 h,可明显地产生活化效应，这与TNFβ诱发淋巴细胞早期产生Ly-CL的强度相一致。结论：适当剂量的rhTNFβ可诱导人外周血淋巴细胞产生OR并促进其增殖。
中国图书分类号 R392.12
Study on the chemiluminescence and proliferation of
lymphocyte induced by rhTNFβ
YU Yue-Han, DING Ming, MA Zhi-Zhang et al.
College of Life Science, Hangzhou University,Hangzhou 310012
Abstract Objective:Study on the mechanism of lymphocyte's activation induced by rhTNFβ with the participation of active oxygen redicals (OR).Methods：It was using chemiluminescence(CL) and electron spin resonance(ESR) techniques. Results：1.The lymphocytes(1×106 ml-1)treated with 10～2 000 U/ml rhTNFβ can induce CL.The highest peak value of CL(RLI)was obtained at 100 U/ml rhTNFβ for 18～20 min.The induced OR was mainly OH·2.After the lymphocyte was treated with 15～62 U/ml rhTNFβ for 72 h,the proliferation effect was obviously observed.This effect was in agree with the CL intensity produced earlier.Conclusion：A suitable dose of rhTNFβ can induce OR production of lymphocyte and promote its proliferation.
Key words rhTNFβ Lymphocyte Chemiluminescence Electron spin resonance(ESR)
肿瘤坏死因子β(Tumor Necrosis Factorβ,TNFβ)又称淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)是由活化淋巴细胞所产生［1］ ,它具有抗肿瘤、抗病毒、诱导成纤维细胞、B细胞和胸腺细胞的增殖、分化以及调节免疫功能等广泛的生物学效应［2］ 。而淋巴细胞化学发光(Lymphocyte Chemiluminescence,Ly-CL)则为淋巴细胞活化早期事件之一［3］ 。据此，本文采用淋巴细胞化学发光(Ly-CL)和顺磁共振法(Electron Spin Resonance,ESR)研究TNFβ诱导人外周淋巴细胞产生活性氧自由基(Oxygen Radicals,OR)释放水平的动态变化及其与淋巴细胞增殖的相关性，为探讨活性氧参与TNFβ诱导淋巴细胞活化的作用机理提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 外周血淋巴细胞制备 按常规方法进行，细胞存活率＞97％，粒细胞比例＜3％。
1.2 药品和试剂 RPMI-1640(Gibco)按常规配制成完全1640，2-ME(Fluka),DMPO(Sigma)，Luminol(Sigma)按司传平方法配置工作液［3］，MTT(Sigma),黄嘌呤(Xanthine,X，Sigma),黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase,XOD，Sigma)，rhTNFβ(由本实验室制备，电泳纯,细胞毒比活性为5×106 U/mG·P)［4］，其余试剂均为国产。
1.3 淋巴细胞化学发光(LY-CL)的测定
1.3.1 仪器 BPCL超微弱智能发光测量仪(中科院生物物理所)。测量参数：测量时间10 s,标准光源计数1 000 s-1，测量电压1 100 V。测定结果由发光仪10 s计数自动记录，发光值(Relative Light Indensity, RLI)以加TNFβ后出现的Ly-CL值(RLI)的最高峰为峰值，达到峰值的时间为峰时，以对照组的RLI为本底，各处理组的峰值减去本底为纯峰值，并连续测定发光的动力学。
1.3.2 TNFβ诱导淋巴细胞化学发光的检测 取1.0×106 ml-1淋巴细胞或不同密度的淋巴细胞1 ml，加luminol工作液0.2 ml，测其本底后，再分别加入不同浓度的TNFβ或在不同密度的淋巴细胞中加入同一浓度(100 U/ml)TNFβ，并即刻测定其发光值。以此研究不同浓度的TNFβ对同一密度淋巴细胞以及同一浓度的TNFβ对不同密度淋巴细胞诱发Ly-CL(RLI)的影响。
1.4 顺磁共振法检测活性氧［5］
1.4.1 FeSO4 -H2O-DMPO捕捉羟自由基的体系(Fenton反应体系) 依次加入3%H2O2 1 200 μl， 0.1 mmol/L FeSO4 600 μl，0.2 mol/L DMPO 200 μl，混匀后2 min，用石英毛细管吸少量溶液后密封，置ESR谐振室测试。
1.4.2 黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-DMPO捕捉超氧阴离子的体系 取0.3 mol/L黄嘌呤1 200 μl,0.1 mmol/L EDTA 50 μl，0.2 mol/L DMPO 200 μl和1 U/ml黄嘌呤氧化酶500 μl混匀后2 min，取样置ESR谐振室测试。
1.5 TNFβ诱导人外周淋巴细胞的增殖作用 用1640完全培养液调整淋巴细胞，使其在96孔板中每孔细胞密度为1×105 /100 μl和不同浓度的TNFβ/100 μl，置37℃，5％CO2 、饱和湿度条件下培养72 h，实验结束前加10 μl(5 mg/ml)MTT，继续培养4 h，加DMSO 150 μl/孔置振荡器上振荡5 min，用酶标仪测每孔OD570值。
2 结果
2.1 TNFβ诱导淋巴细胞化学发光的动态变化 根据检测,淋巴细胞自身的化学发光值为2 085 RLI。当加入TNFβ后，即可诱导发出较强的化学发光(CL)，不同浓度TNFβ所诱发的Ly-CL及其动态变化有一定差异(图1)。经50 min的间断测定表明，各不同浓度组的峰值出现于18～20 min之间，随后即逐渐衰减，至50 min时已趋平稳。比较各不同浓度组Ly-CL的峰值则以100U/ml组为最高,达到22 997 RLI。值得注意的是500～2 000 U/ml TNFβ的高剂量组，其诱发的RLI，均随剂量的增高而下降。
图1 不同浓度TNFβ诱导人外周血淋巴细胞(1.0×106 ml-1)化学发光的动态变化
Fig.1 The kinetic curves of chemiluminescence indentsity from human PBEC stimulated by TNFβ
2.2 淋巴细胞密度与TNFβ诱导Ly-CL的相关性
表1表明，TNFβ诱导Ly-CL的强度与细胞密度相关。当TNFβ剂量为100 U/ml，淋巴细胞密度为0.2×106～2.0×106 ml-1时，RLI与细胞密度呈线性关系。但随细胞量的进一步提高(＞2.0×106 ml-1)则不再呈现线性关系。
表1 TNFβ(100 U/ml)刺激不同密度淋巴细胞的发光效应
Tab.1 Influence of different contents of lymphocytes on the Chemiluminescence stimulated by TNFβ(100 U/ml)
| Contention of | Background | CL peak value | Peak-time |
| Lymphocyte(×106 ml-1) | (RLI) | (RLI) | (Min) |
| 0.1 | 434±26 | 10 349±1 1451) | 7 |
| 0.5 | 1 210±84 | 4 4740±1 4461) | 9 |
| 1.0 | 2 085±151 | 8 1950±3 6301) | 11 |
| 2.0 | 3 930±243 | 12 5483±4 6931) | 12 |
| 5.0 | 5 321±412 | 15 4940±9 3801) | 14 |
Note: 1)P＜0.01,compared with control TNFβ: 100 U/ml
2.3 顺磁共振检测的初步结果 分别在FeSO4-H2O2 -DMPO捕捉OH· 和X-XOD- DMPO捕捉
2.4 TNFβ诱导淋巴细胞的增殖 TNFβ的浓度在15～62 U/ml范围内，其促进外周血淋巴细胞的增殖效应随着TNFβ浓度的增高而增强；但当浓度进一步增高(＞62 U/ml)，这种促增殖效应逐渐减弱，而当浓度达到 1000U/ml时，则表现为抑制作用(图2)。
图2 TNFβ对外周血淋巴细胞的增殖影响
Fig.2 Effect of TNFβ on human peripheral blood lymphocytes proliferation
3 讨论
淋巴细胞化学发光(Ly-CL)是淋巴细胞活化的一种表现［6,7］ ，其本质是淋巴细胞受抗原或有丝分裂原刺激后生成活性氧的反应［8,9］ 。我们的研究显示TNFβ可诱导人外周淋巴细胞产生化学发光，其强度(峰值)在10～100 U/ml的TNFβ诱导下与其浓度呈正相关，但在500～2 000 U/ml时，则随TNFβ的浓度增高而下降。值得注意的是，TNFβ诱导淋巴细胞化学发光的峰时比ConA/PHA诱导为长，在18～20 min左右，而后者仅2～3 min。当TNFβ的浓度不变，Ly-CL强度与淋巴细胞密度呈线性关系，但当密度＞2.0×106 ml-1时，则Ly-CL无明显增加。对此现象值得进一步作比较研究。
以DMPO为自旋捕捉剂对经TNFβ诱导的淋巴细胞样品进行检测，获得明显的自由基信号，4条主要吸收峰与DMPO捕捉的标准OH· ESR波谱相一致，说明本实验DMPO捕捉到的是淋巴细胞所释放的OH·。这一结果提示，TNFβ激发淋巴细胞产生化学发光的本质是释放羟自由基。它参与淋巴细胞的活化，并认为OR的生成是淋巴细胞活化的一种阳性信号［10］ 。
研究不同浓度TNFβ对淋巴细胞的诱导增殖作用，发现在15～62 U/ml范围时，可有效地活化淋巴细胞，这与淋巴细胞早期诱发Ly-CL的强度相一致。但当浓度＞62 U/ml以上，淋巴细胞的增殖即渐趋降低，这与100 U/ml浓度的TNFβ诱发Ly-CL的最高峰值不完全一致；而当浓度＞500 U/ml则表现出抑制效应。就TNFβ而论,对淋巴细胞这种调节作用将为TNFβ应用于临床提供了实验依据，对其作用机理尚待进一步阐明。
资金项目：国家自然科学基金资助项目(批准号：39670815)，浙江省自然科学基金资助项目(批准号：397050)
作者简介：俞越汉，男，36岁，硕士；马志章，女，57岁，教授，主要从事肿瘤免疫研究
参考文献
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收稿:1998-06-05 修回:1999-01-20