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黄芩类黄酮对人免疫细胞化学发光及淋巴细胞增殖的影响①
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 中医中药与免疫
作者:贺海平 秦箐 陈明 Ami Kharazmi Soren Brogger Christensen
单位:贺海平(广西肿瘤防治研究所 南宁 530021);秦 箐(广西医科大学);陈 明(广西医科大学)
关键词:黄芩;类黄酮;化学发光;淋巴细胞增殖
摘 要:目的:探讨黄芩类黄酮对人免疫细胞影响。方法:检测了从黄芩中纯化的3′,5,6,7-四羟基-2′,8-二甲氧基黄酮、2′,5-二羟基-6,6′,7,8-四甲氧基黄酮、5,7,8-三羟基黄酮、(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-五羟基黄烷醇、黄芩甙和黄芩酮6种类黄酮成分对人多形核细胞(PMN)、单个核细胞(MNC)化学发光反应和PHA诱导淋巴细胞增殖的影响。结果:除(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-五羟基黄烷醇外,其它5种抑制N-Fomyl-Met-Leu-Phe(fMLP)激活的PMN和MNC或调理酵母多糖(OZ)激活的PMN产生的化学发光,也显著地抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖,在2.5×10-4mol/L浓度时抑制化学发光的抑制率可达41%~99%。抑制淋巴细胞增殖的抑制率可达89%~99%。结论:从黄芩中分离的类黄酮对PMN、MNC和淋巴细胞有不同的作用。这些作用可能与黄芩的抗炎症和抗过敏作用有关系。也显示这些成分有可能成为新的抗炎或免疫抑制药物。
中国图书分类号:R392.12 R28
Effects of flavonoids isolated from Scutellaria baicalensis georgi on chemiluminescence response of immunological cells and proliferation of human lymphocytes
HE Hai-Ping
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
QIN Jing
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
CHEN Ming
(Department of Biochemistry,Guangxi Cancer Institute,Nanning 530021)
Abstract:Objective:Studied the effects of flavonoids isolated from Scutellaria baicalensis georgi on immunological cells.Methods:It was tested that the effect of 3′,5,6,7-tetrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone,2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone,5,7,8-trihydroxyflavone,(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol,which isolated from Scutellaria baicalensis georgi on chemiluminescence(CL) response of human ploymorphonuclear cells(PMN) and mononuclear cells(MNC) and PHA-induced proliferation of human lymphocytes.Results: It was found that six compounds with the exception of 2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol strongly inhibited fMLP and opsonized zymosan(OZ)-induced CL and significantly inhibited PHA-induced lymphocyte proliferation.At 2.5×10-4mol/L concentration inhibited CL by 41% to 99% and showed the significant inhibited PHA-induced lymphocyte proliferation by 89% to 99%.Conclusion:It indicated that the effects of the flavonoids on neutrophils,MNC and lymphocytes were variable,that the effects may contribute to the known anti-inflammatory and anti-allergy actions of Scutellaria baicalensis georgi and these compounds may have potential as anti-inflammatory immunosuppressive drugs.
Key words:Scutellaria baicalensis georgi Flavonoid Chemiluminescence Lymphocyte proliferation▲
黄芩是我国和日本的一种传统的中草药,从古至今,已被用于治疗过敏性和传染性疾病[1,2]。现代的研究显示黄芩的粗提物和提取的成分具有抗真菌[3]、抗突变[4]、抗病毒[5]、抗炎症[6]、抗血管平滑肌细胞增殖[1]、抑制NAD(P)H[7]和抗肿瘤等效应[8]。为了进一步了解黄芩对免疫功能的影响,我们从黄芩提取有效成分,并检测了从黄芩中纯化的6种黄酮成分对PMN、MNC化学发光反应和PHA诱导淋巴细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 黄芩化学提取物的制备 3′,5,6,7-四羟基-2′,8-二甲氧基黄酮、2′,5-二羟基-6,6′,7,8-四甲氧基黄酮、5,7,8-三羟基黄酮和(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-五羟基黄烷醇从黄芩中分离纯化。并经化学结构分析。黄芩甙和黄芩酮从Aldrich(德国)购买。其结构式见表1。黄芩类黄酮溶解于二甲基亚砜(DMSO)后,用含1%人白蛋白的KRB(Krebs Ringers Buffer,pH7.2)稀释。DMSO在培养基的终浓度小于0.1%(V/V)。对照试验显示DMSO在该浓度不影响淋巴细胞增殖和化学发光。
表1 6种黄芩类黄酮的化学结构
Tab.1 Chemical structures of 6 flavonoids from Scutellaria baicalensis georgi
No. | 3 | 5 | 6 | 7 | 8 | 2′ | 3′ | 6′ | C2-3 | |
1 | Baicalein | OH | OH | OH | u | |||||
2 | Baicalin | OH | OH | OGLD | u | |||||
3 | 3′,5,6,7-tetrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone, | OH | OH | OH | OCH3 | OCH3 | OH | u | ||
4 | 2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone | OH | OCH3 | OCH3 | OCH3 | OH | OCH3 | u | ||
5 | 5,7,8-trihydroxyflavone | OH | OH | OH | u | |||||
6 | (2R,3R)-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol | OH | OH | OH | OH | OH | s |
1.2 PMN和MNC制备 取健康人全血,枸橼酸钠抗凝,左旋糖苷沉淀,Sodium-metrizoate Ficoll(Lymphoprep,Nyegaard,Oslo,Norway)分离。残余的红细胞用低渗法去除。嗜中性粒细胞悬液纯度大于98%。MNC用非特异性酯酶染色,悬液含15%~18%的MNC。用胎酚蓝染色细胞活性大于98%。
1.3 化学发光反应 激活或非激活的PMN的化学发光产物用鲁米诺增强系统检测。使用两种激活剂调理酵母多糖(OZ)和fMLP。①OZ,10 mg酵母多糖(Sigma)、70 ml KRB和3 ml AB型血清混合,置于37℃孵育30 min后,3 000 r/min离心10 min。沉淀物重悬于KRB中(1 mg/ml)。②fMLP,溶于KRB中,使用时终浓度为10-5mol/L。
一份的细胞悬液(当用OZ作激活剂测定时,PMN的浓度为107 ml-1或MNC为2×106 ml-1,当用fMLP作激活剂时,PMN的浓度为2×106 ml-1)加等体积,浓度不同的类黄酮,37℃旋转(20 r/min)孵育30 min。取0.1 ml孵育后的PMN或MNC,0.2 ml OZ或fMLP和0.7 ml发光胺溶液(10-4mol/L),加入3 ml聚苯乙烯小管中。将小管放于光度仪(1251-LKB, Wallac)中检测,连续记录化学发光产物,直到最大的微伏峰出现。
1.4 PHA诱导淋巴细胞增殖 PHA诱导的淋巴细胞增殖按我室常规方法进行。简单说,单个核细胞淋巴细胞悬于含10%小牛血清、青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中(Gibco Lab.美国),浓度为6.5×105 cell/ml。取135 μl分种于96孔板中,加25 μl的PHA溶液(Murex,英国),PHA的终浓度为75 μg/ml。37℃(5%CO2)孵育48 h。加入不同浓度的类黄酮和l μCi的3H-胸腺嘧啶(Amersham International plc,英国),继续培养18 h。用收集仪收集细胞,干燥滤膜。用beta计数仪(Matrix96,PACKARD)记录同位素放射量,每组平行作3孔,计算胸腺嘧啶的摄入量的均值(DMP)和标准差,用统计学检验显著性差异。各种类黄酮对淋巴细胞增殖的抑制率按下公式计算:
2 结果
2.1 类黄酮对fMLP和OZ激活的嗜中性粒细胞化学发光反应的影响 6种黄酮中的5种(1,2,3,4,5)抑制fMLP激活的PMNs产生的化学发光(见表2)。最低浓度(2.5×10-7mol/L)时的抑制率为18%~33%。在2.5×10-4 mol/L浓度时抑制率为41%~99%,奇怪的是成分3在2.5×10-4mol/L浓度时抑制率为99%,但10倍稀释后迅速降到12%。成分6即使浓度达2.5×10-4mol/L对化学发光均无影响。
表2 6种不同浓度类黄酮对fMLP或OZ激活PMN化学发光的抑制率(x±s,n=3,mol/L)
Tab.2 Percentage inhibition of various concentrations of six compounds in PMNs chemiluminescence stimulated by fMLP or OZ(x±s,n=3,mol/L)
Compound | Stimulated by OZ | Stimulated by fMLP | ||||||
2.5×10-4 | 2.5×10-5 | 2.5×10-6 | 2.5×10-7 | 2.5×10-4 | 2.5×10-5 | 2.5×10-6 | 2.5×10-7 | |
Baicalein | 95±0 | 61±0 | 31±3 | 23±1 | 101±0 | 97±0 | 83±1 | 50±4 |
Baicalin | 41±0 | 10±2 | 15±4 | 18±5 | 80±8 | 54±7 | 18±8 | 19±9 |
3′,5,6′ 7-tetrahydroxy-8′dimethoxyflavone, | 99±1 | 12±0 | 19±2 | 18±1 | 102±0 | 36±15 | 26±12 | 32±10 |
2′,5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone | 74±1 | 48±1 | 30±1 | 33±2 | 100±0 | 93±0 | 70±2 | 34±1 |
5,7,8-trihydroxyflavone | 93±0 | 48±2 | 31±4 | 33±2 | 101±0 | 98±1 | 86±3 | 45±3 |
(2R,3R-2′,3,5,6′,7-pentahydroxyflavanonol | 4±2 | 5±1 | 4±1 | -2±2 | -9±4 | -4±13 | -5±8 | 5±6 |
类黄酮抑制OZ激活的PMN产生的化学发光与抑制fMLP激活的特征相似。6种类黄酮抑制OZ激活的化学发光反应的强度较fMLP弱。高浓度的成分6不抑制OZ诱导的化学发光。类黄酮抑制OZ激活的MNC产生的化学发光与抑制酵母多糖激活的PMN的特性相似。
2.2 类黄酮对PHA诱导的淋巴细胞增殖的影响 类黄酮(6×10-5~2.5×10-4mol/L)对PHA诱导的淋巴细胞增殖的抑制活性见图1。黄芩酮、2′,5-二羟基-6,6′,7,8-四甲氧基黄酮、5,7,8-三羟基黄酮在浓度为2.50×10-4mol/L时,显著地抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖,抑制率达89%~99%。其抑制率呈浓度依赖关系。(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-五羟基黄烷醇浓度为1.25×10-4mol/L时,对PHA诱导的淋巴细胞增殖无明显抑制作用。
图1 类黄酮对PHA诱导淋巴细胞增殖的影响
Fig.1 Effects of the flavonoids on PHA-induced lymphocyte proliferation
Note:control(C),2′5-dihydroxy-6,6′,7,8-tetramethoxyflaone(DT),5,7,8-trihydroxyflavone(T),(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-Pentahydrooxyflavanonol(P),3′,5,6,7-trtrahydroxy-2′,8-dimethoxyflavone(TD),Baicalein(B-ein),Baicalin(B-in)
3 讨论
化学发光是中性粒细胞呼吸爆发的标志,与毒性的氧衍生物包括过氧化物、过氧化氢、羟自由基和单线态氧的形成和释放有关。本研究检测了6种从黄芩提取的化学成分对中性粒细胞的化学发光的影响。除(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-五羟基黄烷醇外,其余5种类黄酮均强烈地抑制OZ和fMLP诱导的中性粒细胞化学发光反应。结果表明:这些成分可作为抗炎药物或免疫抑制药物。
从以上6种成分的研究结果,还很难阐述其构效关系,主要是研究的成分还不够多。但通过与文献资料比较[9-11]。至少有两个方面的发现:1)Taxifolin和(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-五羟基黄烷醇对化学发光的抑制效应完全不同,表明在B环上C3′和C4′的羟基结构有显著的抑制化学发光反应,而B环上的C2′和C6′羟基结构则无抑制作用。2)柯因(chrysin)和芹菜配质(apigenin)不抑制OZ诱导的化学发光而5,7,8-三羟基黄酮却有抑制作用,这表明A环上8-羟基对抑制化学发光反应有明显的作用。
越来越多的资料表明许多类黄酮在体外对PMN活性氧产生有抑制作用[12]以及对受激活的T淋巴细胞增殖有影响。Oberley等认为膜信号启动细胞分化时,有过氧化物、过氧化氢的形成,葡萄糖摄入增加,使环核苷酸的比率改变[13],这是由于过氧化氢酶和过氧化物酶减少,使细胞内过氧化氢积累,最后诱导细胞分化,氧自由基直接参与触发淋巴细胞活化的起始信号。我们试验显示5种具有抑制嗜中性粒细胞化学发光反应的类黄酮也显著抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖。另一方面(2R,3R)-2′,3,5,6′,7-五羟基黄烷醇不抑制嗜中性粒细胞的化学发光反应也几乎不抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖反应。这清楚地表明:类黄酮对PHA诱导的淋巴细胞增殖抑制的不同,与抑制活性氧形成有关。因此,黄芩类黄酮抑制淋巴细胞增殖,可能是通过抑制氧自由基,继而抑制了淋巴细胞活化起始信号的传递。
小结:从黄芩中分离的类黄酮对人嗜中性粒细胞、单个核细胞和淋巴细胞有不同的作用。3′,5,6′,7-四羟基-2′,8-二甲氧基黄酮是一种新发现的化合物,在体外具有抑制嗜中性粒细胞和单个核细胞的化学发光反应。这些作用可能与黄芩的抗炎症和抗过敏作用有直接的关系。
感谢丹麦国家医院的Anne Asanovski、Hanne Tamstorf、Begit和丹麦皇家药学院给予的试验指导。■
①丹麦Dania奖学金资助
作者简介:贺海平,男,42岁,微生物与免疫学专业硕士,副教授,主要研究肿瘤免疫和肿瘤生化
作者单位:Ami Kharazmi(Clin Microbiol Depart,University Hospital,Denmark)
Soren Brogger Christensen(Depart Medicinal Chemistry,Royal Danish School
Pharmacy,Denmark)
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收稿日期:1998-05-07
修回日期:1999-10-27