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八珍汤对60Co照射小鼠骨髓细胞及相关细胞因子影响的实验研究①
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 中医中药与免疫
作者：祝红焰 谭允育
单位：祝红焰(北京中医药大学微生物免疫学教研室 北京 100029)；谭允育(现在北京针灸骨伤学院微生物与寄生虫学教研室，北京 100102)
关键词：八珍汤；骨髓细胞增殖；细胞因子；小鼠；60Co照射
摘 要：目的：探讨八珍汤对60Co照射小鼠骨髓细胞及相关细胞因子的影响。方法：利用60Co γ射线400 rad一次性全身照射造成小鼠骨髓损伤和免疫低下，观察受照后第七天小鼠骨髓细胞增殖能力、相关细胞因子产生能力以及体内给药八珍汤小、中、大3个剂量〔小剂量：4.6 g/(kg.日)；中剂量：9.2 g/(kg.日)，大剂量：18.4g/(kg.日)〕后以上功能的恢复情况。结果：与正常对照组比较，受照后第7天骨髓细胞增殖能力较正常下降了15.5%，腹腔巨噬细胞产生IL-1、脾细胞产生IL-2的能力均下降(P＜0.05)，脾细胞产生IL-3的能力未受影响。体内给药，与造模对照组比较，八珍汤大、中剂量明显提高受照小鼠骨髓细胞增殖能力(P＜0.001)，两剂量组间无明显差异；八珍汤大、小剂量提高IL-1的产量(P＜0.05);大、中、小3个剂量均可使受照小鼠脾细胞分泌IL-2的功能恢复至正常水平(P＜0.01),3个剂量组间无显著差异；小剂量八珍汤可使造模小鼠细胞产生IL-3能力提高10%(P＜0.01)。结论：八珍汤具有提高受照小鼠骨髓细胞增殖能力及相关细胞因子产生能力，为八珍汤用于治疗造血及免疫缺陷病提供理论依据。
分类号：R967
The effect of Bazhen Decoction on the bone marrow cells and related cytokines of mice exposed to 60Co γ-ray
ZHU Hong-Yan
（Department of Microbiology and Immunology ,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029）
TAN Yun-Yu
（Department of Microbiology and Immunology ,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029）
Abstract：Objective:This study is aimed at exploring the effect of Bazhen Decoction on the bone marrow cells and related cytokines of mice exposed to 60Co γ-ray.Methods:An experimental model of murine bone marrow injury and depressed immunofunctions was established through 60Co γ-ray radiation and the following phenomena were observed.Results:The proliferation of bone marrow cells、IL-1 produced by peritoneal M and IL-2 secreted by splenocytes decreased after seven days in mice exposed to 400 rad 60Co γ-ray.But radiation have little effect on IL-3 produced by splenocytes.Bazhen Decoction significantly enhanced the proliferation of bone marrow cells and the production of IL-1、IL-2 from irradiated mice fed with different doses of Bazhen Decoction in vivo〔small dose:4.6g/(kg.d),moderate dose:9.2g/(kg.d),large dose:18.4g/(kg.d)〕.Bazhen Decoction increased the production of IL-3 from the model control group by 10%.Conclusion:Bazhen Decoction is clinically a hopeful drug used to cure ematopoietic system and immunodeficiency diseases.
Key words：Bazhen Decoction Proliferation of bone marrow cells Cytokines Mice 60Co γ-ray radiation▲
近年来，重组细胞因子由实验室研究进入临床试用，给造血及免疫缺陷病的治疗带来新的希望。研究中药对造血及免疫功能低下动物的细胞因子产生的影响，将为临床治疗该类疾病扩大用药来源。八珍汤源自薛氏医案《正体类要》，为气血双补的经典方，临床广泛用于内科、妇科、皮肤科、眼科等气血亏虚病证，本室曾报导八珍汤对60Co照射所致免疫损伤小鼠有保护作用［1］，为进一步探讨其作用机制，本实验观察了八珍汤对骨髓细胞及相关细胞因子的调节作用。
1 材料与方法
1.1 药物 八珍汤中诸成分购自北京同仁堂药店，均经本校中药鉴定教研室李家实教授鉴定为正品。成人临床常用剂量参考高等医药院校教材《方剂学》第5版(党参3 g、白术10 g、茯苓8 g、炙草5 g、熟地15 g，当归10 g、白芍8 g、川芎5 g)，根据文献折算成小鼠用药量［2］，八珍汤小、中、大剂量分别为成人用药量的5倍、10倍、20倍，即4.6、9.2、18.4 g/(kg.d)，按常规方法制成，煎剂浓度分别为18.5%、37%、74%，每20g小鼠日用量为0.5 ml。
1.2 动物分组 健康NIH雄性小鼠40只，体重18～22 g，购自中国卫生部生物制品研究所，随机分成5组：正常对照组、造模对照组、八珍汤小剂量组、中剂量组、大剂量组，每组各8只小鼠。前2组每只鼠每日用常水灌胃0.5 ml，后3组用中药灌胃0.5 ml，连续10 d。第4天后4组予60Co照射造模，一次性60Co γ射线400 rad全身照射，剂量率213.93伦/min，时间103 s，钴源由北京医科大学钴源室提供，实验第11天所有动物进行实验。
1.3 试剂 RPMI-1640培养基(GIBCO)，另加入L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、10%NCS；LPS、ConA、MTT、SDS均为SIGMA产品；腹腔冲洗液为含5%NCS和肝素的无酚红Hank′s液。
1.4 肺条件培养液制备［3］ 将小鼠处死，在酒精中浸泡，无菌取肺，5只小鼠肺置一个小烧杯中，用RPMI-1640培养液洗2次，一只小鼠的肺置盛有2 ml培养液的10 ml小烧杯中，剪成3～5 mm的碎块，用镊子将肺碎块放入组织培养瓶中(培养体系：RPMI-1640培养液8 ml+FCS 2 ml)，置37℃、5%CO2和完全湿度条件下培养7 d，筛网除去肺碎组织块，培养液体置入瓦氏管中，1 500 r/min离心10 min，上清0.22 μm微孔滤膜过滤，分装于青霉素小瓶中，-20℃保存备用。
1.5 骨髓细胞增殖试验［4］ 无菌取小鼠双股骨骨髓细胞，过4号针头，制成单细胞悬液，用含有20%FCS、10%肺条件培养液的RPMI-1640体系调细胞数至2×105 ml-1，加入96孔板中，每孔200 μl,置37℃、5%CO2和完全湿度条件下培养7 d，于结束前6 h每孔弃去培养上清100 μl，加入浓度为5 mg/ml的MTT 10 μl，培养结束后，每孔加入10%SDS(用0.01mol/L NHCl配制)100 μl，振荡混匀，再放置37℃下4 h，用酶标仪在570 nm处读取OD值。
1.6 腹腔巨噬细胞产生IL-1的功能检测 IL-1的诱生：于实验第7天，给每只小鼠腹腔注射3 ml营养肉汤以激活腹腔巨噬细胞，于实验第11天处死小鼠，IL-1诱生具体见参考文献［5］。IL-1活性检测：胸腺细胞法，MTT比色法检测，参见文献［5］。
1.7 脾淋巴细胞产生IL-2的功能检测 IL-2的诱生参见文献［6］。诱生时间为 36 h。IL-2的活性检测：ConA诱导T细胞微量测定法，MTT比色法测定参见文献［6］。
1.8 脾淋巴细胞产生IL-3的功能检测 IL-3的诱生：方法同IL-2的诱生，诱生时间为48 h。IL-3的活性检测：骨髓干细胞增殖法，MTT比色法测定。参见文献［5］。
2 结果
2.1 骨髓细胞增殖能力 如表1所示，照射后骨髓细胞增殖能力较正常对照组下降了15.5%，给药后，大、中剂量使其增殖能力提高(P＜0.001)，两剂量组间没有差异，小剂量作用不明显。
表1 八珍汤对60Co照射小鼠骨髓细胞增殖能力的影响
Tab.1 Effect of Bazhen Decoction (BD)on the proliferation of bone marrow cells of mice exposed to 60Co γ-ray
| Groups | No.of mice | |
| Normal control | 8 | 0.283±0.013 |
| Model control | 8 | 0.239±0.0111) |
| Small dose of BD | 8 | 0.246±0.011 |
| Moderate dose of BD | 8 | 0.264±0.0152) |
| Large dose of BD | 8 | 0.268±0.0132) |
Note:1)compared with normal control group ,P＜0.001；2) compared with model control group,P＜0.001
2.2 腹腔巨噬细胞产生IL-1的能力 照射后腹腔巨噬细胞产生IL-1的能力降低，给药后，受照小鼠IL-1产生量明显增加，如表2所示，以1∶8稀释度为例，造模对照组与正常对照组比较，P＜0.05；大、小剂量作用显著，与造模对照组比较，P＜0.05，但还没有恢复至正常水平，大小剂量组间无明显差异；中剂量可提高受照小鼠IL-1产量，但无统计学意义。
表2 八珍汤对60Co照射小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响(1∶8稀释度)
Tab.2 Effect of Bazhen Decoction (BD) on IL-1 production of peritoneal M of mice exposed to 60Co γ-ray(1∶8 dilution)
| Groups | n | |
| Normal control | 4 | 0.404±0.051 |
| Model control | 4 | 0.311±0.0231) |
| Small dose of BD | 4 | 0.348±0.0172) |
| Moderate dose of BD | 4 | 0.346±0.029 |
| Large dose of BD | 4 | 0.361±0.0222) |
Note :1)compared with normal control group,P＜0.05;2)compared with model control group,P＜0.05
2.3 脾淋巴细胞产生IL-2的能力 照射使脾细胞分泌IL-2减少，而八珍汤可拮抗这种作用，并使其恢复至正常水平，如表3所示，以1∶4稀释度为例，造模对照组与正常对照组比较，P＜0.05;八珍汤小剂量组与造模对照组比较，P＜0.05;八珍汤大、中剂量组与造模对照组比较，P＜0.01；3个剂量组间差异不显著。
表3 八珍汤对60Co照射小鼠脾淋巴细胞产生IL-2能力的影响(1∶4稀释度)
Tab.3 Effect of Bazhen Decoction (BD) on IL-2 secretion of spenocytes of mice exposed to 60Co γ-ray(1∶4 dilution)
| Groups | n | |
| Normal control | 4 | 0.383±0.011 |
| Model control | 4 | 0.363±0.0111) |
| Small dose of BD | 4 | 0.405±0.0183) |
| Moderate dose of BD | 4 | 0.407±0.0182) |
| Large dose of BD | 4 | 0.392±0.0102) |
Note:1)compared with normal control group,P＜0.05;2) compared with model control group,P＜0.01;3) compared with model control group,P＜0.05
2.4 脾淋巴细胞产生IL-3的能力 表4所示，经过照射，脾细胞分泌IL-3的能力未受到损伤，八珍汤小剂量组可使造模对照组小鼠脾细胞IL-3的分泌提高了10%(P＜0.01)。
表4 八珍汤对60Co照射小鼠脾淋巴细胞产生IL-3能力的影响(1∶4稀释度)
Tab.4 Effect of Bazhen Decoction (BD) on IL-3 production of splenocytes of mice exposed to 60Co γ-ray (1∶4 dilution)
|
Groups |
n | |
| Normal control | 4 | 0.576±0.024 |
| Model control | 4 | 0.582±0.021 |
| Small dose of BD | 4 | 0.637±0.0111) |
| Moderate dose of BD | 4 | 0.608±0.013 |
| Large dose of BD | 4 | 0.588±0.036 |
Note :1)compared with model control group, P＜0.01
3 讨论
骨髓造血系统及免疫系统对辐射最敏感，临床观察，肿瘤患者接受放化疗以及慢性辐性射病患者表现为一派气血亏虚症状，易于招致感染及抗肿瘤能力下降。本实验结果显示：受照后第7天，小鼠骨髓细胞增殖能力较正常下降了15.5%，腹腔巨噬细胞产生IL-1及脾细胞产生IL-2的能力均下降，气血双补方剂八珍汤可以提高受照小鼠骨髓细胞增殖能力，提高腹腔巨噬细胞分泌IL-1及脾细胞分泌IL-2的能力，同时小剂量八珍汤可使造模小鼠脾细胞产生IL-3提高10%。
IL-1是迄今为止抗放效应最强的细胞因子，它通过直接参与启动造血干、祖细胞的活化过程，增加骨髓中粒细胞系和巨噬细胞系造血祖细胞比例，动员骨髓造血细胞进入细胞周期中发生敏感性相对较低的晚S期等有关［7，8］。IL-2有多种免疫增强效应，在众多的细胞因子网络中起重要的作用。许多实验结果证明，IL-2有使免疫缺陷机体的免疫功能部分重建的作用。实验表明，外源性IL-2对辐射损伤有一定程度的恢复作用，通过增强细胞增殖，并使细胞膜表面抗原重新表达而发挥作用［9］。IL-3可促进各种细胞集落的形成，首先是粒、单核细胞系，随着IL-3浓度的增加，可依次促进巨核细胞系、红细胞系集落的形成，另外，IL-3还与骨髓前体细胞膜稳定性及细胞活性的维持密切相关。由此看来，八珍汤是通过提高骨髓细胞增殖及相关细胞因子产生，并对骨髓造血系统及免疫系统进行调控，达到使机体骨髓造血机能恢复、免疫低下得以纠正，免于细菌、病毒侵袭，为八珍汤用于造血及免疫缺陷病治疗提供理论依据。
本实验中照射后脾细胞生成IL-3能力并未受到损伤，与文献报道照后4 d血清中粒系刺激活性趋于降低，照后7～10 d显示一定程度的升高是一致的［11］。IL-3产生随照射后时间不同，其变化也可能是不相同的。照后7 d IL-3损伤不明显的可能原因：照后7 d造血组织系统可反馈性使IL-3生成较照后早期相对增加，而机体利用减少。IL-3作用增强而造血功能仍低下，有实验报道推断照射后血清中有抑制造血活性物质存在［10］，本实验机理是否与其一致，还有待进一步研究。照射后机体造血系统及免疫系统是一个动态变化过程，为进一步探讨八珍汤药理作用机理，仍需对八珍汤进行动态研究。■
①人事部非教育系统留学回国人员基金资助项目中国医药科成(1998)38号
作者简介：祝红焰，女，29岁，免疫学专业硕士研究生；
谭允育，女，60岁，教授，硕士生导师，主要从事中药免疫调节作用机制的研究
参考文献：
［1］谭允育，黄守雄，龙猛山 et al.八珍汤对60Co照射小鼠免疫功能影响的实验研究.中国免疫学杂志，1995；11(1)：38
［2］陈 奇主编.中药药理实验方法.北京：人民卫生出版社，1994：205-207
［3］唐佩弦，杨天楹主编.造血细胞培养技术.西安：陕西科学技术出版社，1985：206-207
［4］王洪斌，郑钦岳.四种检测集落刺激因子方法的比较.中华血液学杂志，1991；12(6)：323
［5］杨贵贞主编.免疫生物工程纲要与技术.长春：吉林科学技术出版社，1991：17-18，96-98
［6］钱玉昆主编.实用免疫学新技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1994：49-50
［7］黄向东.细胞因子抗放作用的研究进展.国外医学.放射医学核医学分册，1992；16(3)：97
［8］卯新民，李永寿.白介素1的抗放射线效应.甘肃医学，1993；12(1)：14
［9］周金黄主编.免疫药理学进展.基础与临床.北京：中国科学技术出版社，1993：499-513
［10］陶来宝，陈家佩.小鼠血清中的粒系造血活性及其照后改变.中华放射医学与防护杂志，1995；15(1)：20
收稿日期：1998-12-31
修回日期：1999-11-08