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HBV基因组转染对小鼠NIH3T3细胞内基质金属蛋白酶组织抑制因子的转录调控作用
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 分子与细胞免疫学
单位：谭龙益(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心 上海 200003)；林淑英(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心 上海 200003)；周付才(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心 上海 200003)；孔宪涛(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心 上海 200003)
关键词：基质金属蛋白酶组织抑制因子；乙型肝炎病毒；基因转染
摘 要：目的：阐明乙型肝炎病毒(HBV)基因组转染对基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)的转录调控作用。方法：应用磷酸钙转染技术构建表达HBsAg和HBeAg的小鼠NIH3T3细胞克隆，以该细胞为模型，应用原位杂交技术测定细胞内特异性TIMP RNA含量变化。结果：表达HBsAg和HBeAg细胞内TIMP1和TIMP2 RNA含量显著升高。结论：HBV基因组转染能显著增强细胞内TIMP的转录，促进TIMP的合成，使金属蛋白酶活性受抑制，导致肝脏细胞基质的降解减少，沉积增多，可能是肝炎后肝硬化发生的机理之一。
分类号：R392.11
Transfection of HBV genome and its effect on the mRNA level of tissue inhibitor of metalloproteinase in mouse fibroblast NIH3T3 cells
TAN Long-Yi
（Center of Clinial Immunology,Changzheng Hospital,The Third Military Medical College,Shanghai 200003）
LIN Shu-Ying
（Center of Clinial Immunology,Changzheng Hospital,The Third Military Medical College,Shanghai 200003）
ZHOU Fu-Cai
（Center of Clinial Immunology,Changzheng Hospital,The Third Military Medical College,Shanghai 200003）
Abstract：Objective:To understand the mechanism of liver cirrhosis after the infection of hepatitis B virus.Methods:Mouse fibroblast NIH3T3 cells were transfected with 3.2 kb HBV DND by exposure of the cells to calcium phosphate.The change of the levels of mRNA for tissue inhibitor of metalloproteinase 1and 2(TIMP1，2) was detected in mouse fibroblast NIH3T3 cells and the cells of transfection with HBV Genome by in situ hybridization.Results:The levels of mRNA for TIMP1 and TIMP2 were increased significantly.Conclusion:HBV infection can induce the expression of the mRNA for TIMP1 and TIMP2.
Key words：Tissue inhibitor of metalloproteinase Hepatitis B virus Genome transfection▲
肝脏纤维化是各种肝脏疾病向肝硬化发展的病理过程，是细胞外基质(ECM)在肝脏内过度沉积的结果。ECM的过度沉积与ECM分泌过度有关，更大程度上是由于ECM降解减少。在ECM降解过程中起主导作用的基质金属蛋白酶(MMP)受到基质金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase， TIMP)的调控［1］。在我国，乙型肝炎病毒(HBV)感染是人类肝脏纤维化发生的主要原因之一［2］，HBV感染是否能直接影响ECM的代谢调节尚不清楚。本文以HBV基因组转染细胞为模型，探索了HBV基因组对TIMP-1和TIMP2的转录调控作用，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料 小鼠NIH3T3细胞，本中心保存；pBluescript质粒，携带双拷贝adr型HBV-DNA，雷章恒博士提供；PCNCX质粒：携带新霉素抗性基因(neoR)的真核细胞表达载体，张鲁蓉博士提供；PGEN-tm33：含0.7 kb TIMP-1 DNA，Hiraoka教授惠赠；pGUT-off质粒：含0.8 kb TIMP-2 DNA，Liotta博士惠赠；地高辛标记和检测试剂盒：Boehringer Mannheim公司生产。
1.2 方法
1.2.1 表达HBsAg和HBeAg的细胞克隆的建立 参见文献［3］，限制性内切酶消化pBluescript质粒，回收3.2 kb HBV DNA，待与磷酸钙转染试剂形成小颗粒后，加至细胞表面，16 h后，加入新鲜DMEM培养基。48 h更换含G418 500 mg/L DMEM培养基。培养第30天，挑取细胞克隆，应用ELISA测定细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg，Southern blot杂交测定整合于细胞染色体中的HBV DNA，原位杂交检测细胞质HBV RNA，扩增并保存HBV基因组表达克隆。
1.2.2 地高辛标记的TIMP cDNA和HBV DNA探针的制备 特异性限制性内切酶消化相应质粒，回收特异性DNA片段，应用地高辛标记特异性DNA片段，按试剂盒说明进行。
1.2.3 原位杂交技术测定细胞内TIMP-1，TIMP-2 mRNA 克隆化细胞悬液分别滴加于5张盖玻片上，继续培养24 h，去培养基，PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3次，Proteinase K 1 μg/ml 37℃ 20 min，0.2%甘氨酸PBS室温15 min，4%多聚甲醛后固定3 min，PBS洗3次，70%、90%、100%乙醇脱水，空气干燥，50%甲酰胺，60℃ 20 min，100 μl预杂交液42℃ 3 h，去除预杂交液，50 μl杂交液(含特异性 cDNA探针100 pg/ml)，湿盒，42℃，16 h，50%甲酰胺 2×SSC，37℃，30 min，50%甲酰胺 1×SSC，37℃，30 min×2，0.1×SSC，37℃，30 min×2，Buffer 1 5 min，Buffer 2 30 min，抗地高辛抗体 75 μl/ml，37℃，30 min，Buffer 1，15 min×2，Buffer 3 2～5 min，显色液避光湿盒放置10 h，50 ml水洗，封片，计算机灰度扫描，每张玻片计算100个细胞的平均灰度值。
2 结果
应用磷酸钙转染技术获得表达HBsAg和HBeAg的NIH3T3细胞克隆2个［3］，地高辛标记的TIMP-1和TIMP-2 cDNA探针分别对HBV基因组转染前后的NIH3T3细胞进行原位杂交，结果见图1和表1，HBV基因组织的转染的小鼠NIH3T3细胞内TIMP-1和TIMP-2 mRNA都有显著提高。
图1 TIMP-1 DNA 探针杂交的NIH3T3细胞(200×)
Fig.1 NIH3T3 cells transfected with 3.2 kb HBV genome were in situ hybridized with tissue inhibitor metalloproteinsae-1 cDNA probe(200×)
表1 HBV基因组转染对TIMP表达影响
Tab.1 NIH3T3 cells were transfected with 3.2 kb HBV genome,the cells were in situ hybridization with tissue inhibitor metalloproteinsae-1 and 2 cDNA probe
| NIH3T3 cell | NIH 3T3 cell transfected with HBV genome | P | |
| TIMP-1 | 25±10.5 | 67±14.2 | ＜0.01 |
| TIMP-2 | 36±13.1 | 59±11.3 | ＜0.01 |
Note:The average density of every 100 cells were detected
3 讨论
TIMP家族至少包括4个基因［4］，蛋白质分子中包括可溶性的TIMP-1、TIMP-2和构成细胞外基质成分的TIMP-3。其分子量分别29、22和22 kD。TIMP-1、TIMP-2均具有抑制MP、促进细胞增殖的活性。体内多种细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和枯否氏细胞等均可合成TIMP。新分离的Ito细胞仅分泌低水平TIMP，当Ito细胞被激活时，合成TIPM的能力提高［5］，当Ito细胞受伤时，TIMP含量急剧增加。新分离的小鼠成纤维细胞表达较高水平的TIMP，随着细胞在体外传代次数的增加和培养时间的延长，TIMP的合成减少［6］。将亚油酸羟基过氧化物加入成纤维细胞培养基中，TIPM含量大幅度增加［7］。多种生长因子和白细胞介素-6都能促进TIMP的合成［8］。在慢性肝脏疾病和肝硬化发生时，血清TIMP-1和TIMP-2都显著升高，在酒精性肝硬化患者血清中，TIMP水平与肝纤维化等呈正相关。
我国是肝硬化高发区，而且大多数都发生在HBV感染基础上，HBV感染是否对TIMP基因表达有直接的影响尚罕见报道。本研究结果显示，在HBV基因组转染的成纤维细胞中，TIMP-1和TIMP-2 mRNA的含量都显著增加，提示HBV感染能够促进患者体内TIMP的分泌，抑制MMP活性，使ECM降解减少，导致ECM代谢失去平衡，促进肝脏纤维化发生。HBV感染促进TIMP转录的机制不清楚，可能与HBV基因的表达产物X蛋白有关，X蛋白是一种反式激活因子，可非特异地激活多种基因的表达。其详细机制有待进一步探讨。■
作者简介：谭龙益，男，42岁，博士，主要研究肝脏纤维化形成机制
参考文献：
［1］Denhardt D T,Feng B,Edwards D R et al.Tissue inhibitor of metalloproterinase:structure control of expression and biological functions.Pharmacol Ther,1996;59(3):329
［2］全国肝病协作组.肝细胞癌与肝硬变和乙型肝炎的关系.中华医学杂志，1982；6(4)：257
［3］谭龙益，王 皓，孔宪涛.表达HbsAg和HbeAg的小鼠成纤维细胞克隆的建立.上海免疫学杂志，1998；18(1)：15
［4］Anand A B,Bao L A.Review of tissue inhibitor of metalloprotein-3(TIMP-3) and experimental analysis of its effect on primary tumor growth.Biochem Cell Bol,1996;74(6):853
［5］Arthur M J,Iredale J P.Hepatic lipocytes,TIMP-1 and liver fibrosis.J R Coll Physicians Lond,1994;28(3):200
［6］Millis A J,Hoyle M,McCue H M et al.Differential expression of metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase gene in aged fibroblasts.Exp Cell Res,1992;201(20:373)
［7］Tyagi S C,Meyer L,Kumar S.Induction of tissue inhibitor of metalloproteinase and its mitogenic response to endothelial cells in human atherosclerotic and restenotic lesions.Can J Cardiol,1996;12(4):353
［8］Edwards D R,Heath J K,Hogan B L.Expression of TIMP in fetal and adult mouse tissues studied by in situ hybridization.Matris Suppl,1992;1:286
收稿日期：1998-09-29
修回日期：1998-10-18