rBPI 23 基因克隆与鉴定

rBPI₂₃基因克隆与鉴定

中国免疫学杂志 2000年第6期第16卷 免疫学技术与方法

作者：柯岩　安云庆　杨贵贞

单位：柯岩（首都医科大学微生物学和免疫学教研室，北京 100054）；安云庆（首都医科大学微生物学和免疫学教研室，北京 100054）；杨贵贞（白求恩医科大学免疫学教研室，长春 130021）

关键词：重组杀菌/渗透增强蛋白-23(rBPI23)；PUC18克隆载体；RT-PCR

　　摘　要　目的：rBPI₂₃基因(BPI_{600 bp})克隆与鉴定。方法：采用RT-PCR技术，从HL-60细胞mRNA中扩增编码BPI N端199个氨基酸(rBPI₂₃)的基因片段(BPI_{600 bp})，经酶切后通过连接反应构建重组克隆载体，测序鉴定。结果：RT-PCR获得预期的扩增产物—BPI_{600 bp}基因片段。成功构建PUC18-BPI₁₈₀、PUC18-BPI₄₂₀重组克隆载体，酶切、酶谱分析与预期结果相符。DNA测序结果与文献报道一致。结论：PUC18-BPI₁₈₀、PUC18-BPI₄₂₀重组克隆载体构建成功；BPI_{600 bp}基因序列与文献报道一致。

　　中国图书分类号　Q785

Cloning and identification of rBPI₂₃ gene(BPI_{600 bp})

KE Yan,AN Yun-Qing

　　（Department of Microbiology and Immunology， Capital University of Medical Sciences,Beijing 100054）

　　YANG Gui-Zhen

　　（Department of Immunology， Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021）

　　Abstract　Objective:To clone and identify BPI_{600 bp} gene which encode rBPI₂₃.Methods:The gene which encode rBPI₂₃ were amplified by RT-PCR from mRNA that were extracted from HL-60.Recombinant cloning vector was constructed sequenced after the enzyme digestion.Results:①Prospective amplified products-BPI_{600 bp} gene was obtained by RT-PCR method.②PUC18-BPI₁₈₀、PUC18-BPI₄₂₀ cloning vector were successfully constructed,and the enzyme digestion analysis are identical with prospective results.③Sequences are identical with those of the report.Conclusion:PUC18-BPI₁₈₀、PUC18-BPI₄₂₀ cloning vector were successfully constructed,and BPI_{600 bp} gene sequences are identical with those of the report.

　　Key words　Recombinant bactericidal/permeability increasing protein-23 (rBPI₂₃)　PUC18 cloning vector　RT-PCR

　　革兰氏阴性细菌(G^-菌)感染引发的败血症及其休克在临床有很高的死亡率，细菌脂多糖是感染过程中造成多器官功能衰竭和休克死亡的重要始动因子。因此，探求一种既能杀灭G^-菌又能中和细菌脂多糖毒性效应的疗法，成为当今抗G^-菌感染研究的热点之一^［1］。近年来作为宿主天然防御组成成分的抗菌蛋白或多肽正受到人们的极大关注^［2］。杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是正常存在于人和其它哺乳动物多形核白细胞中的一种阳离子抗菌蛋白。研究表明，重组BPI(rBPI₅₅)或其功能性氨基端片段(rBPI₂₃)与天然BPI(nBPI₅₅)具有完全相同的生物学作用，它们不仅能广谱杀伤G^-菌，还能有效中和细菌内毒素。但药物动力学研究发现，它们在体内的半衰期太短＜1 h)^［3］，因而影响其临床疗效。为此我们提出本项课题研究，拟制备一种由BPI₂₃与IgG Fc嵌合而成的重组蛋白，以期获得一种兼备BPI生物学活性和Ig血清半衰期较长等特性的新型抗菌生物制剂。本文主要介绍该课题研究的前期工作，即BPI₂₃重组蛋白基因克隆和鉴定。

　　1　材料与方法

　　1.1　细胞、菌株和质粒载体　HL-60细胞为本实验室保存细胞株；E.coli DH5α(基因型 supE44▲lacU169(Φ80lacI M15)hsdR17 recAl end A1 gyrA96 thi-1 reA1)为本实验室保存菌株；克隆载体PUC18质粒购自北方同正生物工程公司。

　　1.2　主要试剂　限制性内切酶(EcoRI、HindIII、PstI)购自Promega公司；T4DNA连接酶购自GIBCO/BRL公司；Taq plusI DNA聚合酶购自Sangon生物工程公司；mRNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、质粒提取纯化试剂盒购自Promega公司；DNA回收纯化试剂盒购自原平皓生物制品公司。

　　1.3　引物设计与合成　根据已知人BPI基因序列，设计合成1对引物：P1 5’CAGAATTCATGGTCAACCCTGGCGTCGTG3’；P2 5’GCAAGCTTCTATTTTGGTCATTACTGGCAG3’。5’端引物P1不含N端信号肽序列，含有EcoRI酶切位点和起始密码子ATG；3’端引物P2含有HindIII酶切位点。该对引物所扩增的基因为编码BPI N端1～199个氨基酸的基因。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。

　　1.4　mRNA的提取　按mRNA提取试剂盒说明从HL-60细胞中提取mRNA。①取对数生长期HL-60细胞悬液1.2 ml，置于1.5 ml Eppendorf管中1 000 r/min离心10 min 弃上清，保留沉淀细胞。②用手指弹松离心沉淀的细胞，加入40 μl细胞裂解液轻轻吹打，使细胞溶解，再加入80 μl mRNA提取液I，振动混匀，14 000 r/min离心5 min。③取上清至预分装20 μl mRNA提取液II(含连接poly U的树脂)的薄壁PCR管中混匀，70℃保温2 min后降至室温(18℃～25℃)，静置10 min(每3～5 min振动混匀2～3次)，使mRNA上的poly A与树脂上连接poly U充分结合。④8 000 r/min离心2 min后弃去上清，用200 μl mRNA洗涤液吹打洗涤沉淀物，8 000 r/min离心2 min弃上清。同法洗涤4次后，加入10 μl mRNA保存液振动混匀备用。

　　1.5　RT-PCR扩增获得目的基因　按一步法RT-PCR试剂盒说明进行。逆转录反应体系由mRNA保存液10 μl、反应液I 13 μl(5×RT-PCR缓冲液5 μl、25 mmol/L MgSO₄ 1.5 μl、去离子水6.5 μl)、反应液II 1.5 μl(10 mmol/L dNTP 0.5 μl、引物1 μl、混合酶1 μl AMV逆转录酶0.5 μl、Taq plus I DNA多聚酶0.5 μl)组成。反应程序：48℃逆转录45 min，94℃变性2 min后进行40个PCR循环。循环参数：94℃变性30 s，53.5℃复性40 s，72℃延伸45 s，末次循环后再延伸5 min。

　　取扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据分子量Marker标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的基因(BPI_{600 bp}DNA片段)的凝胶，按DNA快速纯化回收试剂盒操作步骤纯化回收扩增产物。

　　1.6　PUC18-BPI₁₈₀、PUC18-BPI₄₂₀、重组克隆载体的构建、筛选和鉴定　用EcoRI和HindIII对扩增产物BPI_{600 bp}DNA片段进行双酶切获得BPI_{180 bp}和BPI_{420 bp}2个DNA片段。同时用EcoRI和EcoRI/HindIII分别对PUC18质粒进行酶切反应，前者(EcoRI酶切产物)经去磷酸化处理后，通过连接反应与BPI_{180 bp}基因片段结合构成PUC18-BPI₁₈₀重组克隆载体；后者(EcoRI/HindIII酶切产物)通过连接反应与BPI_{420 bp}基因片段结合构成PUC18-BPI₄₂₀重组克隆载体。上述重组克隆载体转化E.coli DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌。小量提取质粒后，用EcoRI/HindIII和EcoRI/PstI分别酶切PUC18-BPI₄₂₀重组克隆载体进行酶切分析和酶谱鉴定。以上各步均参照文献［4］进行。

　　1.7　DNA序列分析　从阳性克隆菌中小量提取质粒DNA，以M13 Reverse primer为引物进行全自动测序(由北京赛百盛生物工程公司测定)。

　　2　结果

　　2.1　RT-PCR扩增产物的鉴定　RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量约600 bp处呈现1条与预期产物分子量大小相符的DNA条带(图1)。PCR扩增产物经EcoRI/HindIII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，在分子量约420 bp和180 bp处呈现2条与预期酶切产物分子量大小相符的DNA条带(图2)。

图1　RT-PCR产物

　　Fig.1　Products from RT-PCR

　　Note:1.pBR332 DNA/MspI marker;2.BPI_{600 bp} from RT-PCR

图2　BPI_{600 bp}酶切产物

　　Fig.2　Product of BPI_{600 bp} by enzyme digestion

　　Note:1.pBR322 DNA/MspI marker;2.BPI_{600 bp} by EcoRI/HindIII digestion(180 bp/420 bp)

　　2.2　PUC18-BPI₁₈₀、PUC18-BPI₂₄₀重组克隆载体的筛选和鉴定　通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌，小量提取质粒后经酶切和酶谱分析发现：①PUC18-BPI₁₈₀重组克隆载体经EcoRI酶切后获得1个分子量约180 bp的基因片段；经PstI酶切后获得1个分子量约145 bp的基因片段(图3)。②PUC18-BPI₄₂₀重组克隆载体经EcoRI/HindIII酶切后获得1个分子量约420 bp的基因片段；经EcoRI/PstI酶切后获得1个分子量约230 bp的基因片段(图4)。上述各酶切片段与预期结果相符，表明BPI_{180 bp}、BPI_{420 bp}已分别整合插入到PUC18相应酶切位点之间。

图3　PUC18-BPI_{180 bp}酶切鉴定

　　Fig.3　Identification of PUC18-BPI_{180 bp} by enzyme digestion

　　Note:1.pBR322 DNA/MspI marker;2.PUC18-BPI_{180 bp} by EocRI digestion(180 bp);

　　3.PUC18-BPI_{180 bp} by PstI digestion(145 bp)

图4　PUC18-BPI_{420 bp}酶切鉴定

　　Fig.4　Identification of PUC18-BPI_{420 bp} by enzyme digestion

　　Note:1.pBR322 DNA/MspI marker;2.PUC18-BPI_{420 bp} by EcoRI/HindIII digestion(420 bp);

　　3.Negative clone;4.PUC18-BPI_{420 bp}by EcoRI/PstI digestion(230 bp)

　　2.3　PCR产物的测序结果　测序结果如图5所示，与文献报道一致。基因全长约600 bp，编码199个氨基酸。5’端第180～186位核苷酸处含有1个EcoRI酶切位点；5’端第45～168位核苷酸和第507～579位核苷酸所编码的氨基酸区域为细菌脂多糖结合部位。

图5　BPI_{600 bp}基因序列

　　Fig.5　The sequence of BPI_{600 bp} gene

　　3　讨论

　　目前临床对革兰氏阴性细菌感染引发的败血症和感染性休克尚无有效的防治办法^［5］。常规抗生素治疗效果不够理想，主要原因是抗生素耐药菌株不断增加影响疗效；细菌对抗生素高度敏感可因大量死亡裂解而加重内毒素血症^［6］。根据发病机制，近年采用抗LPS单克隆抗体、抗炎性细胞因子单克隆抗体和抗炎性细胞因子受体单克隆抗体进行免疫治疗也未获得令人满意的效果^［7］。天然BPI、重组BPI或其氨基端功能性片段(rBPI₂₃)虽然具有广谱杀伤G^-菌和中和细菌内毒素的作用，但因其血清半衰期太短而影响其临床实际应用。为此我们提出了制备BPI₂₃-Fcγ，重组蛋白的课题研究，以期获得良好的临床治疗效果。本文主要介绍该课题研究的前期工作。首先根据编码BPI氨基端199个氨基酸的基因序列设计合成了1对与之相匹配的引物，并采用RT-PCR技术从HL-60细胞mRNA中成功地扩增获得了目的基因—BPI_{600 bp}基因片段。该目的基因经EcoRI/HindIII酶切后获得BPI_{180 bp}和BPI_{420 bp}2个基因片段，与预期结果相符。实验选择具有纠错功能的Taq plus I DNA polymerase参加反应，保证了PCR反应的可靠性、特异性和成功率。

　　PUC18质粒为克隆/测序载体，除含有1个氨苄青霉素抗性基因(Amp^r)外，还有1个插入失活的lacZ基因，其内具有多克隆位点。PUC18质粒载体经EcoRI/HindIII双酶切和EcoRI单酶切形成粘性末端后，与具有粘性末端的BPI_{420 bp}和BPI_{180 bp}片段，通过连接反应成功构建形成PUC18-BPI_{420 bp}和PUC18-BPI_{180 bp}重组质粒载体。当上述外源性基因片段插入PUC18多克隆位点后，可使重组质粒中的lac Z基因失活。因此，重组质粒转化的细菌在含X-gal和IPTG的LB氨苄抗性选择固体培养基上可形成白色菌落。据此，我们获得了含PUC18-BPI₁₈₀和PUC18-BPI₄₂₀重组质粒的细菌。增菌小量提取质粒后，对所提质粒进行酶切酶谱分析鉴定，结果发现各酶切片段与预期结果相符，表明BPI_{180 bp}和BPI_{420 bp}基因片段已分别整合插入到PUC18质粒载体相应酶切位点之间。DNA序列分析结果与文献报道一致，证实RT-PCR扩增产物确为编码BPI N端199个氨基酸的基因片段。

　　PUC18-BPI₁₈₀和PUC18-BPI₄₂₀重组克隆质粒的获得，为BPI₂₃-Fcγ重组蛋白的研制奠定了工作基础。

　　国家自然科学基金资助项目(项目号：39570666)

　　作者简介：柯岩，男，30岁，博士生，主要从事抗感染免疫研究；

　　安云庆，男，53岁，教授，博士生导师，主要从事抗感染免疫研究

　　参考文献

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　　2，Marra M N,Wilde C G,Collins M S et al.The role of bactericidal/permeability-increasing protein as a natural inhibitor of bacterial endotoxin.J Immunol,1992;148(2):532

　　3，Robert J B,Kenneth D,Nneka O I et al.The role of liver and kidney on the pharmacokinetics of a recombinant amino terminal fragment of bactericidal/permeability-increasing protein in rats.Pharm Res,1997;14(2):224

　　4，Sambrook J， Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual. 2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1989:55,237-456

　　5，Dahlberg P S,Acton R D，Battafarano R J.A novel endotoxin antagonist attennates tumor necrosis factor-alpha secrection.J Surg Res,1996;63:44

　　6，Verhoef J,Hustinx W M,Frase H et al.Issues in the adjunct therapy of severe sepsis.J Antimicrob Chemother,1996;38(2):167

　　7，Mccloskey R U,Straube R C,Sander C et al.Treatment of Septic shock with human monoclonal antibody HA-1A.Ann Intern Med,1994;121:1

1999-08-30